工作簡況1、背景糖化血紅蛋白是2型糖尿病診斷以及病情監(jiān)測的關鍵指標。因型糖尿病患者眾多，因此其檢驗量巨大。目前，該檢測方法主要以高效液相色譜法等方法為主，相關核心技術來源于國外，并且效率低、成本高、抗干擾能力差。本標準特選擇檢測效率高、成本低、抗干擾能力強的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術進行糖化血紅蛋白的檢測，該技術適用于檢測通量高、成本控制要求嚴格的檢驗環(huán)境，并且該方法抗干擾能力強，尤其適用于我國復雜的血紅蛋白變異環(huán)境，屬于我國自主創(chuàng)新技術，有極大的推廣意義。《人全血糖化血紅蛋白檢測—基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法》系融智生物科技（青島）有限公司等企業(yè)在所研制生產的“新一代寬譜定量飛行時間質譜平臺QuanTOF”的基礎上，開發(fā)的具有自主知識產權和核心技術的糖化血紅蛋白質譜定量檢測方法。2021年1月，融智生物科技（青島）有限公司等單位起草完成了《人全血糖化血紅蛋白檢測—基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法》企業(yè)標準（企業(yè)標準號QB-IntelliBio-012-2021），并于2021年2月1日開始實施。上述標準制訂參與企業(yè)并進一步推廣該方法為團體標準等工作。2022年，相關文件提交中國分析測試協(xié)會及中關村材料試驗技術聯盟申報團體標準。2、起草單位、起草人（按拼音排序）A、起草單位：北京大學深圳醫(yī)院、北京融智優(yōu)譜生物科技有限公司、廣東默迪優(yōu)譜生物科技有限公司、杭州意誠默迪生物科技有限公司、南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、融智生物科技（青島）有限公司、上海伍豐科學儀器有限公司、首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院、煙臺大學生命科學院、中國科學院生物物理研究所；B、主要起草人：紀玲、李晨、李巖、李運濤、馬昱、宋合興、孫德慧、孫朋衛(wèi)、王緒敏、王玉璽、溫斌斌、吳軼、謝雯春、徐安平、張瑞、周宏偉、周曉光標準編制原則和確定標準的依據本標準編制過程中參考或引用了以下相關標準：GB/T191包裝儲運圖示標志GB4793.1測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第1部分：通用要求GB4793.6-2008測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第6部分:實驗室用材料加熱設備的特殊要求GB4793.9測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第9部分：實驗室用分析和其他目的自動和半自動設備的特殊要求GB7247.1激光產品的安全第1部分：設備分類、要求GB/T14710醫(yī)用電氣環(huán)境要求及試驗方法GB/T18268.1測量、控制和實驗室用的電設備電磁兼容性要求第1部分：通用要求GB/T18268.26測量、控制和實驗室用的電設備電磁兼容性要求第26部分：特殊要求體外診斷(IVD)醫(yī)療設備YY0648測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第2-101部分：體外診斷（IVD）醫(yī)用設備專用要求GB/T21415—2008體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制物質賦值的計量學溯源性GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T38576-2020人類血液樣本采集與處理JJF1528-2015飛行時間質譜儀校準規(guī)范WS/T461-2015中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《糖化血紅蛋白檢測》當前國內外共有數十家基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀研發(fā)、生產和相關技術開發(fā)企業(yè)，但不同企業(yè)提供的質譜儀性能存在差異，尤其是對蛋白大分子的靈敏度、質量分辨能力和線性范圍，以及定量重現性能力不均，這些性能將極大地影響到基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對糖化血紅蛋白檢測的能力，因此，本標準規(guī)范了基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀的相關基礎性能要求以及檢測方法學流程等，并參考和引用了國家標準、行業(yè)標準中對糖化血紅蛋白檢測儀、糖化血紅蛋白檢測方法的相關規(guī)范。標準制定的主要內容1、范圍的確定擬制定的標準適用于人全血中糖化血紅蛋白的相對含量測定。2、人全血糖化血紅蛋白含量測定方法及指標的確定目前常用的人全血糖化血紅蛋白相對含量測定方法包括高效液相色譜法、電泳法以及免疫測定法等，其中IFCC（國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯盟）以液相色譜-串聯質譜法作為參考方法。目前已使用的各種方法中，較適宜臨床使用的主要是高效液相色譜法等，但人類血紅蛋白情況復雜，尤其是我國跨越緯度較高，不同緯度人群血紅蛋白的差異明顯，尤其是我國南方地區(qū)。這些差異造成現有方法存在較大測試干擾，因而對進一步的確診、精準治療都有影響。擬起草的標準采用了MALDI-TOFMS（基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法），并分析了常見干擾情況，對現有方法在抗干擾以及精準醫(yī)療等方面進行了延伸。3、正確度、精密度測試擬起草的標準在測試正確度、精密度等方面引用了WS/T461-2015《糖化血紅蛋白檢測》的相關要求。3.1精密度驗證2個濃度水平質控物分別每天重復測定3次，共5天，統(tǒng)計均值、標準差和變異系數（CV）。按照CLSIEP15-A評價方案，室內變異系數（CV)小于3%，以小于2%為宜。注：（1）目前許多測定方法的室內CV小于2%。（2）只有控制室內CV小于2%，才能實現室間CV小于3.5%。（3）HbA1C測定質量目標：小于0.5%HbA1C。3.2正確度至少兩個水平標準物質，每個水平標準物質3個平行樣本，每個樣本重復測定6次。與可接受參考值的差值在±0.5%HbA1c范圍內，以控制±0.3%HbA1c范圍內為宜。正確度驗證方法，包括但不限于以下方式：-參加室間質量評價（能力驗證）計劃；-采用恰當的有證標準物質；-與運行經過認證分析系統(tǒng)的有資質實驗室的測定結果進行比對。3.3線性在檢測區(qū)間范圍內，檢測結果的相關系數r應不小于0.990。本標準所載的方法經融智生物科技（青島）有限公司以及煙臺大學生命科學院、中國農業(yè)大學信息獲取重點實驗室、安徽皖測食品檢測公司、上海市食品研究所、北京大學深圳醫(yī)院等實驗室進行高、中、低值的三個樣本平行比對實驗，測試結果滿足WS/T461-2015對準確度以及相對偏差等的要求。結果見下表：實驗室樣本糖化值（%）測試值（%）偏差（%）煙臺大學生命科學院A14.84.80A210.4110.450.3842459A316.0916.06-0.186451中國農業(yè)大學信息獲取重點實驗室A14.84.79-0.208333A210.4110.420.0960615A316.0916.04-0.310752安徽皖測食品檢測公司A14.84.810.2083333A210.4110.470.5763689A316.0916.10.0621504上海市食品研究所A14.84.79-0.208333A210.4110.39-0.192123A316.0916.05-0.248602北京大學深圳醫(yī)院A14.84.912.2916667A210.419.94-4.51489A316.0915.48-3.7911754、抗干擾和異常樣本測試情況抗干擾能力及糖化血紅蛋白變體情況評估表1.QuanTOF用于糖化血紅蛋白定量分析抗干擾評估InterferencesBias,%Bias,mmol/molBilirubin(≤304.0μmol/L)≤0.1≤1Triglycerides(≤22.8mmol/L)≤0.1≤1cHb(≤8.7%)≤0.2≤2LabileA1c(≤12.2%)≤0.2≤2HbF(≤8.0%)≤0.2≤2HbF(>8.0%)>0.2>2HbJ-Bangkok-0.24HbCoushatta-0.21HbG-Taipei≤0.1HbQ-Thailand-0.27HbG-Honolulu≤0.2HbAS:qualityseparationSglobinchainseparatedfromotherfractionsTruenessHbA1c(n=2)0.5,0.45,4HbAC:qualityseparationCglobinchaincoeluteswithHbATruenessHbA1c(n=3)≤0.2≤2HbAD:qualityseparationDglobinchaincoeluteswithHbATruenessHbA1c(n=5)≤0.2≤2HbAE:qualityseparationEglobinchaincoeluteswithHbATruenessHbA1c(n=10)≤0.2≤2A.1不穩(wěn)定糖化血紅蛋白測定3例樣本的紅細胞的糖化血紅蛋白值，包括正常水平(4.8%；29mmol/mol)，中等水平(6.6%；49mmol/mol)，和高等水平(10.0%；86mmol/mol)。將這三個樣本與葡萄糖溶液在37℃下孵育1.5小時，每30分鐘測一次糖化血紅蛋白HbA1c和不穩(wěn)定的HbA1c。不穩(wěn)定的HbA1c用VariantIIAnalyzer定量分析，計算不穩(wěn)定HbA1c濃度的偏差。結果表明，MALDI-TOF質荷比在15000~16000范圍內沒有檢測到被修飾的血紅蛋白。質譜定量值與基準HbA1c值相比，即使不穩(wěn)定HbA1c比例高達12.2%，不同持續(xù)時間葡萄糖處理樣本的HbA1c水平偏差均在0.2%（3mmol/mol）以內（見表1）。A.2氨甲酰血紅蛋白（cHb）氨甲酰血紅蛋白對于HbA1c的干擾是通過上述4.5.1中三個樣本進行評估的。紅細胞與氰酸鉀（1mmol/mol），37℃下孵育3小時。HbA1c和cHb每小時測一次。cHb由VariantIIAnalyzer定量分析，將含有不同cHb濃度的樣本的HbA1c值與基線HbA1c進行比較。經氰酸鉀處理后，在質譜圖中，即使氨甲酰血紅蛋白高達8.7%，也未對結果產生有統(tǒng)計學意義的影響（見表1）。A.3膽紅素和甘油三酯用糖化血紅蛋白為正常濃度（5.6%，38mmol/mol）和高濃度（8.7%，72mmol/mol）的兩個樣本來評估甘油三酯和膽紅素的影響。兩個樣本的紅細胞與不同濃度的甘油三酯和膽紅素血漿混合，使甘油三酯和膽紅素的終濃度分別為22.8mmol/L和304.0μmol/L。膽紅素和甘油三酯濃度分別達到304.0mol/L和22.8mmol/L時，未對結果產生有統(tǒng)計學意義的影響（見表1）。A.4影響β珠蛋白含量計算的特殊變體干擾除了基于常規(guī)β鏈糖基化對HbA1c進行定量分析外，實驗數據還表明，使用α鏈糖基化計算的HbA1c值與Ultra2結果之間具有良好的一致性，因此支持使用α鏈糖基化來評估HbA1c的水平。最重要的發(fā)現是，通過使用α鏈糖基化可以完全克服由于β鏈變體的存在而對HbA1c的測量造成的干擾。類似地，通過使用β鏈糖基化可以消除由α鏈糖基化產生的臨床上顯著的干擾。顯而易見的原因是由于兩者之間存在足夠的質量差異，變體β鏈無法同時影響α鏈及其糖基化形式，反之亦然。當檢測樣本存在影響β珠蛋白含量計算的特殊變體干擾時，可通過公式（3）進行。以HBF為例，HbF對于HbA1c定量的干擾評估是通過臍帶血與三個樣本進行混合，這三個樣本HbA1c的濃度分別為正常水平（5.6%，38mmol/mol），中等水平（6.7%，50mmol/mol），高水平（9.2%，77mmol/mol）。通過Capillarys3TERA的測定HbF水平為0.8%~14.2%。HbF存在時，質譜圖中出現γ-珠蛋白鏈（m/z=15,997.4）峰（見圖2）。HbF在低于8.0%時不會顯著影響糖化血紅蛋白定量結果。當HbF含量大于約8.0%時，HbA1c值的偏差超過0.2%（2mmol/mol）。此外，隨著HbF百分比的增加，偏差也隨之增加（見表1）。此時，糖化比率計算方式可更換為以下公式：血紅蛋白糖化率計算公式：HbA1c%=式中：Aα——斜率Bα——常數SGlc-αHb——糖化α-Hb的峰面積SαHb——非糖化α-Hb的峰面積表2.QuanTOF定量分析血紅蛋白變體HbvariantVariantchainMassdifference/DaDetectablebyQuanTOFPopulationfrequencyinChinaHbHamiltonβchain14Yes0.015%HbNewYorkβchain30Yes0.143%HbJ-Bangkokβchain58Yes0.020%HbSanDiegoβchain32Yes0.005%HBBc.41C>Tβchain28Yes0.005%HbBinyangαchain16Yes0.005%HbPhnomPenhαchain113Yes0.025%HbQ-Thailandαchain22Yes0.035%HbG-Coushattaβchain-58Yes0.010%HbAmsterdamαchain-18Yes0.0049%HbHekinanαchain-14Yes0.119%HbRushβchain-1No0.005%A.5其他常見血紅蛋白變體很多血紅蛋白變體并未影響本方法的測試結果。通過樣品分析研究了血紅蛋白變異的干擾，這些樣本包括HbAS（n=2）,HbAD（n=5）,HbAC（n=3），和HbAE（n=10）。所有雜合血紅蛋白變異均通過Sanger測序確認。用QuanTOF和硼酸鹽親和高效液相色譜法（Ultra2,TrinityBiotech）測定其變異。用這兩種方法進行比較是因為硼酸鹽親和作用的結果被認為不受血紅蛋白變異的影響。隨后用QuanTOF測得的HbA1c值和與Ultra2測得的HbA1c值比較。在血紅蛋白變異體HbS，HbD，HbC和HbE中，HbA1c的定量偏差均在可接受范圍內（見表1）。圖2.正常和變異血紅蛋白的MALDI-TOF質譜圖。圖2A顯示了具有MH+1已知質量的正常樣品的質譜圖，該質量為α球蛋白（m/z=15,127.0）和β球蛋白亞基（m/z=15,868.0）以及相應的糖化β球蛋白（m/z=16,031.0）和糖化的α珠蛋白（m/z=15,289.0）。高質量的其他已知峰是芥子酸