《分子生物學(xué)》復(fù)習(xí)指南《分子生物學(xué)》復(fù)習(xí)指南答案一、名解1、基因：是含有生物信息的DNA片段，根據(jù)這些生物信息可以編碼具有生物功能的產(chǎn)物，包括RNA和多肽鏈。(課件)2、分子伴侶(MolecularChaperone)：又稱為伴侶蛋白，是一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的保守性蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)協(xié)助其它多肽結(jié)構(gòu)完成正確的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，在功能完成后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時(shí)的組份。3、RFLP：即限制性片段長度多態(tài)性。高度重復(fù)序列中的無間隔反向重復(fù)序列很容易形成限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，也很容易由于突變產(chǎn)生或失去一個(gè)酶切位點(diǎn)，因而可以造成限制性片段長度多態(tài)性。即用同一種限制性內(nèi)切酶消化不同個(gè)體的同一段DNA時(shí)，由于堿基組成的變化而改變限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，從而會產(chǎn)生長度不同的DNA片段，這種方法稱為限制性片段長度多態(tài)性，簡稱RFLP技術(shù)。4、DNA的復(fù)制（replication）：以構(gòu)成基因組的全套核酸分子為模板，精確合成一套新的核酸分子的過程。遺傳信息通過親代DNA分子的復(fù)制傳遞給子代，在保持生物物種遺傳的穩(wěn)定性方面起著重要的作用。5、反轉(zhuǎn)錄：又稱逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription），是以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成雙鏈DNA的反應(yīng)。6、克隆載體：可攜帶插入的外源DNA片段并可轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增的DNA分子。該分子中含有能夠在受體細(xì)胞中自主復(fù)制的序列和篩選標(biāo)記，常用于外源基因的克隆，如噬菌體或質(zhì)粒。7、功能基因組：細(xì)胞內(nèi)所有具有生物學(xué)功能的基因。表達(dá)一定功能的全部基因所組成的DNA序列，包括編碼基因和調(diào)控基因。8、核不均一RNA：即hnRNA,即前體mRNA，在真核生物中，最初轉(zhuǎn)錄生成的RNA,存在于真核生物細(xì)胞核中的不穩(wěn)定、大小不均的一組高分子RNA之總稱。由外顯子和內(nèi)顯子組成，需經(jīng)過剪接加工及各種修飾后，形成成熟的mRNA。9、分子雜交：由來源不同的兩個(gè)脫氧核糖核酸單鏈或核糖核酸單鏈結(jié)合成雙鏈分子的過程。確定單鏈核酸堿基序列的技術(shù)，其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術(shù)可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進(jìn)行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。10、RNA編輯：是RNA加工的一種特殊方式，是通過對mRNA的加工使遺傳信息在mRNA水平上發(fā)生改變。有少數(shù)真核基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的成熟mRNA序列與相應(yīng)基因的編碼序列有差異，這些差異是在轉(zhuǎn)錄物上增加、刪除或取代某些核苷酸后形成的，這種編輯后的mRNA才是有翻譯功能的mRNA分子。11、操縱子：原核生物基因多以操縱子（operon）的形式存在。操縱子由調(diào)控區(qū)和信息區(qū)組成，上游是調(diào)控區(qū)，包括啟動(dòng)子（promoter）與操縱元件（operator）二部分。操縱元件：特異的阻遏物結(jié)合區(qū)。12、啟動(dòng)子：是RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)及其周圍的一組轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件（包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)以及典型的TATA盒）。二、填空轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：是指用DNA重組技術(shù)將外源基因?qū)雱?dòng)物基因組內(nèi)，使之能在體內(nèi)表達(dá)并穩(wěn)定地遺傳給后代的一類動(dòng)物。端粒酶組成：蛋白質(zhì)和RNA共同組成，能以自身的RNA為模板反復(fù)延伸端麗DNA的重復(fù)序列。載體類型：克隆載體和表達(dá)載體（書上）常用載體：DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質(zhì)粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNAphage），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達(dá)載體，測序載體，穿梭載體等。基因敲除定義：將細(xì)胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的方法。常用同源重組的方法敲除目的基因，觀察生物或細(xì)胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段。PCR種類：RT-PCR,定量RT-PCR，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，反向PCR，Alu-PCR，原位PCR，巢式PCR，不對稱PCR，固相錨定PCR，長片段PCR，多重PCR?；虼虬屑夹g(shù)：基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種改變生物活體遺傳信息的外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。假基因定義：在多基因家族中某些與正常功能基因在核酸序列上相似，但不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄之后生成無功能基因產(chǎn)物的DNA序列被稱為假基因,用ψ表示?；蛑委煻x：基因治療是指將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對疾病起治療作用。轉(zhuǎn)錄因子類型（狹義）：指通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)或反義核酸技術(shù)、核酶技術(shù)等，使目的基因在體內(nèi)得到表達(dá)，或封閉、剪切致病基因的mRNA，從而達(dá)到治療疾病的目的（廣義）。生殖細(xì)胞基因治療、體細(xì)胞基因治療自殺基因：是指將某些病毒或細(xì)菌的基因?qū)氚屑?xì)胞中，其表達(dá)的酶可催化無毒的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒物質(zhì)，從而導(dǎo)致攜帶該基因的受體細(xì)胞被殺死，此類基因稱為自殺基因。RT-PCR原理：RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCR（reversetranscriptionPCR）和實(shí)時(shí)PCR（realtimePCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。DNA變性：在某些理化因素（溫度、PH、離子強(qiáng)度等）的作用下，DNA雙鏈的互補(bǔ)堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，成為單鏈的現(xiàn)象極為DNA變性。只改變其二級結(jié)構(gòu)，不改變他的核苷酸序列。蛋白質(zhì)分子翻譯后的化學(xué)修飾方式：糖基化、羥基化、甲基化、磷酸化、二硫鍵形成、親脂性修飾.翻譯后蛋白質(zhì)需要進(jìn)行不同形式的共價(jià)修飾，包括肽鏈N端甲硫氨酸殘基的切除，蛋白質(zhì)前體的酶切修飾，氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的磷酸化—去磷酸化、乙?；ヒ阴；?。翻譯后蛋白質(zhì)與糖鏈共價(jià)結(jié)合成糖蛋白，稱糖基化修飾，包括N-糖基化和O-糖基化。膜蛋白經(jīng)過豆蔻?；妥貦磅；戎；揎棽拍芏ㄎ挥谀?。有的蛋白質(zhì)翻譯后由兩個(gè)半胱氨酸殘基上的巰基氧化形成二硫鍵，使蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。也有蛋白質(zhì)需要與金屬離子結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ艿鞍踪|(zhì)。Westernblotting定義：是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。疾病分子機(jī)制研究策略：基因表達(dá)調(diào)控方式類型:1、原核生物：轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控（啟動(dòng)子、S因子、阻遏蛋白、正調(diào)控蛋白）、翻譯水平調(diào)控（SD序列、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯產(chǎn)物的調(diào)控作用）2、真核生物：DNA水平（染色質(zhì)丟失、基因擴(kuò)增、基因重排、DNA甲基化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變）、轉(zhuǎn)錄水平（反式作用因子）原核生物基因表達(dá)的調(diào)控主要為（1）轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（2）轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控①mRNA加工成熟水平上的調(diào)控②翻譯水平上的調(diào)控主要調(diào)控機(jī)制為操縱子真核生物基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)：DNA水平的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，翻譯水平的調(diào)控，翻譯后水平的調(diào)控（見P62和第八章）管家基因：有些基因產(chǎn)物對生命全過程都是必須的或必不可少的。這類基因在一個(gè)生物個(gè)體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，通常被稱為管家基因。順式作用元件：就是指可影響自身基因表達(dá)活性的DNA序列PCR-ELISA分析:即在PCR擴(kuò)增以后，在微也板上借用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）的原理，使用酶標(biāo)抗體，進(jìn)行固相雜交來實(shí)現(xiàn)定量。被稱為PCR－ELISA：反式作用因子：真核細(xì)胞內(nèi)含有大量的序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因開放或關(guān)閉，稱為反式作用因子，簡稱反式因子。也稱為基因特異性轉(zhuǎn)錄因子，是一類細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)因子。原核細(xì)胞DNA的甲基化位點(diǎn)：三、選擇題真核細(xì)胞參與基因表達(dá)調(diào)節(jié)的調(diào)控區(qū)比原核細(xì)胞復(fù)雜原因：多級調(diào)控在真核基因表達(dá)的調(diào)控中，上游調(diào)控元件（UCE）能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的速率基因突變類型:點(diǎn)突變、移碼突變、缺失突變、插入突變（按堿基變化情況分）同義突變、錯(cuò)義突變、無義突變（按影響分）溴化乙錠是一種___試劑：高靈敏度的熒光染色劑，常用于觀察PAGE或瓊脂糖凝膠中的核酸；合成DNA及RNA的抑制劑及誘變劑；分離和測定核酸結(jié)構(gòu)（網(wǎng)上搜的，僅供參考）Dicer蛋白是:Dicer是RNA干擾中起核心作用的一種dsRNase。（網(wǎng)上搜的，僅供參考）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)原理：以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)分子基因治療靶細(xì)胞類型:生殖細(xì)胞、體細(xì)胞基因診斷技術(shù)類型：核酸分子雜交、PCR技術(shù)、DNA序列測定、DNA芯片技術(shù)真核生物基因的順式作用元件類型：啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子元件，增強(qiáng)子，反應(yīng)元件和poly（A)加尾信號原核基因基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：基因密度高，基因組序列中編碼區(qū)所占比例較大；重復(fù)序列很少；含有同工酶的同基因；不同原核生物基因組中的GC含量變化很大。受體作用的特點(diǎn)：高度特異性、高親和力、可飽和性和可逆性。12、DNA指紋：DNA經(jīng)限制酶酶切后，以重復(fù)序列中的核心序列為探針進(jìn)行DNA印跡雜交所形成的雜交帶型。13、分子伴侶特點(diǎn)：分子伴侶又稱伴侶蛋白，是一類序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的保守性蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞內(nèi)能協(xié)助其他多肽結(jié)構(gòu)完成正確的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解。分子伴侶本身不包括控制正確折疊所需的構(gòu)象信息，但是能阻止非天然態(tài)多肽鏈的錯(cuò)誤折疊或凝集，給處于折疊中間態(tài)的多肽鏈提供更多的正確折疊的機(jī)會，因而它們能提高折疊的產(chǎn)率但不一定能提高其速度。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)至少有兩類伴侶蛋白家族，即熱休克蛋白家族和伴侶素。14、反式作用因子的激活方式：通過基因表達(dá)產(chǎn)生反式作用因子、共價(jià)修飾調(diào)節(jié)蛋白的活性、與配體結(jié)合引起功能變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用。15、真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法：磷酸鈣共沉淀法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、電鉆孔法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、DEAE-葡萄糖法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染、顯微注射法。16、真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用主要環(huán)節(jié)：反式作用因子通過結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。17、功能基因組學(xué)研究的內(nèi)容是：基因組的表達(dá)、蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能、基因組多樣性的研究、基因組功能注釋等。18、限制性內(nèi)切酶切割特點(diǎn)：能識別雙鏈DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并且裂解磷酸二酯鍵19、轉(zhuǎn)基因方法：基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法是以病毒載體作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)移的非生物學(xué)方法是利用各種非病毒介質(zhì)作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，如：脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞表面受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移、直接注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移、其他。20、蛋白質(zhì)生物合成肽鏈的方向是:21、基因工程使用的工具酶有哪些：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA多聚酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA連接酶等。22、真核生物的mRNA帽子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：甲基化鳥苷酸以5'磷酸基團(tuán)連接mRNA5'端形成帽子結(jié)構(gòu)，有Ⅰ型帽子結(jié)構(gòu)和Ⅱ型帽子結(jié)構(gòu)。23、DNA損傷修復(fù)方式：原核細(xì)胞：直接修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)、SOS修復(fù)真核細(xì)胞：細(xì)胞周期檢查點(diǎn)控制24、克隆載體類型：常見克隆載體主要來自質(zhì)粒和病毒25、DNA損傷的方式：交聯(lián)、斷裂、堿基突變、DNA重組四、判斷題1.分子生物學(xué)是研究對象：核酸、蛋白質(zhì)等所有生物大分子的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征及其重要性、規(guī)律性和相互關(guān)系的科學(xué)，2.點(diǎn)突變：也稱作單堿基替換，指由于DNA復(fù)制過程中的自發(fā)突變或由于物理、化學(xué)原因?qū)е碌膯螇A基改變發(fā)生的突變，可以分為轉(zhuǎn)換和顛換3.基因定點(diǎn)誘變（Site-directedmutagenesis），是在體外特異性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一個(gè)特定堿基的技術(shù),包括盒式取代誘變、寡核苷酸引物誘變及PCR定點(diǎn)誘變等。在DNA水平上產(chǎn)生多肽編碼順序的特異性改變稱為基因的定向誘變。4.基因診斷：主要是應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測人體某些基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)的變化，或者檢測病原體基因組在人體內(nèi)的存在，從而達(dá)到診斷疾病或監(jiān)控疾病治療效果的目的。將分子生物學(xué)技術(shù)用于診斷疾病，可能達(dá)到前所未有的特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡便快速的目的?；蛟\斷將成為疾病診斷的一個(gè)重要方面，也將成為法醫(yī)學(xué)的一個(gè)重要手段。5.反義RNA和siRNA：反義RNA：與靶核酸(如mRNA或有義DNA)鏈互補(bǔ)的RNA分子，可抑制靶核酸的功能，導(dǎo)致正常翻譯終止的RNA分子。根據(jù)反義RNA的作用機(jī)制可將其分為3類：Ⅰ類反義RNA直接作用于靶mRNA的SD序列和(或)部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被RNA酶Ⅲ降解；Ⅱ類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；Ⅲ類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA是指與mRNA互補(bǔ)的RNA分子，也包括與其它RNA互補(bǔ)的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合,即抑制了該mRNA的翻譯。通過反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式。siRNA：小干擾RNA（SmallinterferingRNA；siRNA）有時(shí)稱為短干擾RNA（shortinterferingRNA）或沉默RNA（silencingRNA），是一個(gè)長20到25個(gè)核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途。目前已知siRNA主要參與RNA干擾（RNAi）現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。此外，也參與一些與RNAi相關(guān)的反應(yīng)途徑，例如抗病毒機(jī)制或是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。siRNA有如下特點(diǎn)：1.長度約在22nt左右。2.依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn)。3.生成需要Argonaute家族蛋白存在。4.是RISC組分。5.siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。6.siRNA一般是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物；植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的siRNA。7.結(jié)構(gòu)上，siRNA是雙鏈RNA。8.在Dicer酶的加工過程中，siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側(cè)臂。9.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并與mRNA完全互補(bǔ)。10.在作用方式上，siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。11.siRNA不參與生物生長，是RNAi的產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和病毒感染。6.NorthernblotNorthernblot是一種通過檢測RNA的表達(dá)水平來檢測基因表達(dá)的方法，通過northernblot的方法可以檢測到細(xì)胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況。指的是RNA分子從膠上轉(zhuǎn)移到膜上的過程，當(dāng)然它現(xiàn)在通指整個(gè)實(shí)驗(yàn)的過程。Northernblot可用來檢測不同組織、器官；生物體不同發(fā)育階段以及脅迫環(huán)境或病理?xiàng)l件下特定基因的表達(dá)樣式。Northernblot還可用來檢測目的基因是否具有可變剪切產(chǎn)物或者重復(fù)序列。Northernblot首先通過電泳的方法將不同的RNA分子依據(jù)其分子量大小加以區(qū)分，然后通過與特定基因互補(bǔ)配對的探針雜交來檢測目的片段。Northernblot的優(yōu)勢在于它可檢測目的片段的大小、是否具有可變剪切出現(xiàn)、可允許探針的部分不配對性，雜交過后的膜經(jīng)過一定的處理除去探針后還可保存很長時(shí)間再次雜交使用。Westernblot稱為蛋白質(zhì)印跡。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。7反式作用因子通過直接結(jié)合或間接作用于DNA、RNA等核酸分子，對基因表達(dá)發(fā)揮不同調(diào)節(jié)作用(激活或抑制)的各類蛋白質(zhì)因子；起反式作用的調(diào)控元件；其本身對基因表達(dá)沒有調(diào)控作用，只是阻斷來自上、下游的調(diào)控效應(yīng)；是指能直接或間接地識別或結(jié)合在各類順式作用元件核心序列上參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的蛋白質(zhì)。（大多數(shù)真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子由某一基因表達(dá)后，可通過另一基因的特異的順式作用元件相互作用，從而激活另一基因的轉(zhuǎn)錄。這種調(diào)節(jié)蛋白稱反式作用因子。）反式作用因子有兩個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域:DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域,它們是其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的必需結(jié)構(gòu)，此外還包含有連接區(qū)。反式作用因子可被誘導(dǎo)合成,其活性也受多種因素的調(diào)節(jié)。同一類序列特異性的反式作用因子由多基因家族所編碼,它們具有特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(如上述的鋅指結(jié)構(gòu)、堿性亮氨酸拉鏈、螺旋-環(huán)-螺旋基元等)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的同源性,因而構(gòu)成反式作用因子家族,如類固醇激素受體家族、AP1家族等。主要包括：1.DNA結(jié)合域：a.螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋b.鋅指結(jié)構(gòu)c.亮氨酸拉鏈d.螺旋-突環(huán)-螺旋8.RT-PCR技術(shù)即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。RT-PCR操作流程：1.從細(xì)胞或特定組織中提取總RNA；2.逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)；3.擴(kuò)增內(nèi)參和目的基因并比較基因表達(dá)差異。RT-PCR影響因素：RT-PCR反應(yīng)受多個(gè)因素影響，如硫酸鎂的濃度,引物退火的溫度，擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)等。

建議選擇0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸鎂作初步實(shí)驗(yàn)。

對于具有較高Tm的引物，增加退火和延伸時(shí)的溫度對反應(yīng)有利。較高的溫度有利于減少非特異的引物結(jié)合，因而提高特異產(chǎn)物的得率。

大多數(shù)目標(biāo)RNA經(jīng)40輪PCR反應(yīng)就能觀察到。但如果目標(biāo)RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加擴(kuò)增的次數(shù)到45-50次。9核酶：具有生物催化功能的RNA，是生物催化劑。又稱核酸類酶，酶RNA,核酶類酶RNA。它的發(fā)現(xiàn)打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。10表達(dá)載體：能使插入基因進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆載體，包括原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒、噬菌體或病毒。典型的表達(dá)載體帶有能使基因表達(dá)的調(diào)控序列，并在適當(dāng)位置有可插入外源基因的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。11蛋白質(zhì)分子模體：模體(motif)屬于蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)，由2個(gè)或2個(gè)以上具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個(gè)特殊的空間構(gòu)象，并發(fā)揮專一的功能。一種類型的模體總有其特征性的氨基酸序列。12提高PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性方法1遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)緊的退火條件提高特異性。2熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。3促進(jìn)PCR的添加劑退火溫度，引物設(shè)計(jì)和鎂離子濃度的優(yōu)化足以對大多數(shù)模板進(jìn)行高特異性的擴(kuò)增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影響DNA熔解溫度的添加劑提供了提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量的另外一種方法。4.巢式PCR使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增可以提高特異性和靈敏度五、簡答題1.基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析策略DNA序列分析:a.雙脫氧鏈末端終止法b.化學(xué)降解法c.DNA序列分析自動(dòng)化核酸分子雜交:Southern、Northern、斑點(diǎn)雜交、原位雜交、液相雜交聚合酶鏈反應(yīng)基因芯片與微陣列Western免疫印跡其它技術(shù)2.基因克隆的基本過程一目的DNA片段的獲得二載體的選擇三體外重組四導(dǎo)入受體細(xì)胞五重組子的篩選常用載體：DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質(zhì)粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNAphage），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達(dá)載體，測序載體，穿梭載體等。常用工具酶：限制性內(nèi)切酶—DNA分子的特異切割。DNA甲基化酶—DNA分子的甲基化。核酸酶—DNA和RNA的非特異切割。核酸聚合酶—DNA和RNA的合成。核酸連接酶—DNA和RNA的的鏈接。核酸末端修飾酶—DNA和RNA的末端修飾。其它—破壁，轉(zhuǎn)化，檢測用酶。3.電子克隆原理與方法原理：電子克?。╥nsilicocloning）是近年來伴隨著基因組和EST計(jì)劃發(fā)展起來的基因克隆新方法，它的主要原理是利用日益發(fā)展的生物信息學(xué)技術(shù)，借助電子計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力，通過EST或基因組的序列組裝和拼接，利用RT-PCR的方法快速獲得功能基因?；谠恚何锓N同源蛋白氨基酸序列相似性（保守性）方法：從GenBank的核酸（nr）數(shù)據(jù)庫中檢索已測序列植物的目的基因，獲得目的基因cDNA序列，以該序列為模板對另一種未測序列植物EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索，獲得與之部分同源的EST群，從中選取一條EST作為種子序列BLAST檢索該植物的EST數(shù)據(jù)庫，將檢出與種子序列同源性較高或有部分重疊的EST序列拼接組裝為重疊群（contig），再以此重疊群序列重復(fù)以上BLAST檢索過程，反復(fù)進(jìn)行EST重疊群序列的拼接和比對，直至檢出所有的重疊EST或重疊群不能繼續(xù)延伸，最終獲得未測序列植物基因的cDNA全序列。4.PCR的原理與方法原理：PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過程。是一項(xiàng)DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的DNA.可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。PCR反應(yīng)基本步驟：1、變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。2、退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55℃，30s）。3、延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70～72℃，30～60s）以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。5.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測方法一染色體和基因水平：1DNA斑點(diǎn)雜交2PCR技術(shù)3Southern印跡法4染色體原位雜交二轉(zhuǎn)錄水平：可采用Northern印跡法、RT-PCR、RNase保護(hù)分析等三翻譯水平：Western印跡雜交或者免疫組織化學(xué)分析方法6.真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)1．DNA水平調(diào)控：基因丟失、基因擴(kuò)增、基因重排、DNA的甲基化與基因調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)調(diào)控。2.轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控：轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，順式作用原件，反作用因子，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制。3.轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控：5’端加帽和3’端多聚腺苷酸化及其調(diào)控，前體mRNA的選擇性剪接。4.翻譯水平調(diào)控:翻譯起始的調(diào)節(jié),mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，小分子RNA對翻譯的調(diào)控作用。5.蛋白質(zhì)加工水平的調(diào)控：7.基因診斷技術(shù)路線與方法8.路線：1直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷途徑2利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間斷診斷途徑9.方法：核酸分子雜交.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR).單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(SSCP).限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析法.DNA序列測定.DNA芯片技術(shù)。10.六、分析論述題基因治療概念：狹義理解：指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合，成為宿主基因組的一部分，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用?；靖拍睿河谜；蛞吧突蛑脫Q致病基因以糾正基因結(jié)構(gòu)和功能異常的一種治療疾病的方法。廣義理解：指通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)或反義核酸技術(shù)、核酶技術(shù)等，使目的基因在體內(nèi)得到表達(dá)，或封閉、剪切致病基因的mRNA，從而達(dá)到治療疾病的目的。基因治療的種類或途徑1.生殖細(xì)胞基因治療2.體細(xì)胞基因治療基因治療的現(xiàn)狀：腫瘤的基因治療，艾滋病的基因治療，遺傳病的基因治療基因治療的策略1.基因替代：去除整個(gè)變異基因，用有功能的正常基因取而代之，使致病基因得到永久的更正。2.基因修正：將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。3.基因增強(qiáng)：將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物可以補(bǔ)償缺陷細(xì)胞的功能或使原有的功能得到加強(qiáng)。4.基因抑制或基因失活：通過導(dǎo)入外源基因去干擾、抑制或破壞有害或異?；虻谋磉_(dá)?；蛑委煹倪m應(yīng)癥或基本條件1.該遺傳病有一定發(fā)病率,且危害嚴(yán)重,現(xiàn)行各種療法、手段無效或療效不佳。2.已經(jīng)在DNA水平上明確其發(fā)病機(jī)理。3.相關(guān)基因已被分離、克隆并了解清楚。4.導(dǎo)入的基因只需低水平表達(dá)即可治愈疾病或改善病情。5.導(dǎo)入基因(外源基因)表達(dá)水平不需嚴(yán)格控制。6.該基因可在體外進(jìn)行操作，且已在體外培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面獲得成功，可靠性好，安全性高?；蛑委煹牟襟E1.目的基因的選擇和制備：人體正?；?基因組DNA、cDNA)或非人體基因。獲取方法：人工合成(DNA化學(xué)合成)、基因克隆或聚合酶鏈反應(yīng)。2.選擇并培養(yǎng)受體細(xì)胞(靶細(xì)胞)3.選擇并準(zhǔn)備適當(dāng)?shù)妮d體質(zhì)粒載體病毒載體4.目的基因與載體連接并篩選鑒定5.將重組體導(dǎo)入靶細(xì)胞,并對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行選擇、鑒定6.效果考核目的基因(標(biāo)志基因)表達(dá)情況臨床癥狀、病情改善情況基因治療的臨床實(shí)踐1.遺傳性疾病的治療(1)地中海貧血(2)血友病2腫瘤的基因治療3、心血管病的基因治療基因治療的展望幾個(gè)問題：基因?qū)胂到y(tǒng)；基因表達(dá)的可控性及更多更好的治療基因。1.高效的、靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)基因治療中的關(guān)鍵問題是能將治療基因輸送到特定靶細(xì)胞，并能在該細(xì)胞中得到高效表達(dá)。2.外源基因表達(dá)的可控性最理想的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控模式。3.更多更好的治療基因目前已用于臨床實(shí)驗(yàn)的治療