1化學品急性經口毒性試驗方法上下增減劑量法(UDP)本文件規(guī)定了化學品急性經口毒性試驗方法——上下增減劑量法（UDP）的范圍、術語和定義、試驗原則、試驗方法、數據和報告。本文件適用于化學品急性經口毒性試驗方法——上下增減劑量法（UDP）。本方法更適用于染毒后一天或兩天內就引起死亡的物質，而不適用于染毒后可能造成預期死亡時間大量延遲（5d或以上）的物質。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。急性經口毒性acuteoraltoxicity將受試物一次或在24h內多次經口給予實驗動物后所產生的不良效應。3.2遲發(fā)性死亡delayeddeath給予受試物48h內未出現實驗動物死亡或瀕死狀態(tài)，但在14d的觀察期間內出現死亡。3.3劑量dose給予實驗動物受試物的量，以質量（g,mg）來表示，或以每單位體重試驗動物所接受的受試物質量來表示（如mg/kg）。3.4劑量級數因子doseprogressionfactor又稱劑量間距因子。是指當一只動物存活時，下一只動物劑量增加（即劑量級數）的倍數；或當一只動物死亡時，下一只動物劑量減少的除數。劑量級數因子建議為1/（劑量-效應曲線的斜率估值）的反對數。默認的劑量級數因子為3.2，即0.5或1/2的反對數。3.5全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度globallyharmonizedsystemofclassificationandlabellingofchemicals（GHS）2GB/T21826—××××全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度，是經濟合作與發(fā)展組織（OECD）（人類健康和環(huán)境）、聯(lián)合國危險貨物運輸專家委員會（UNCETDG理化特性）和國際勞工組織（ILO危險貨物運輸信息傳遞）的聯(lián)合行動產物。并與化學品有效管理機構間規(guī)劃組織（IOMC）負責協(xié)調。3.6瀕臨死亡impendingdeath在下一個計劃觀察點前出現垂死狀態(tài)或死亡。嚙齒類動物瀕臨死亡狀態(tài)的表現有抽搐、側臥、斜躺和震顫。3.7經口半數致死劑量medianlethaloraldose(LD50)經口給予受試物后導致50%實驗動物死亡的統(tǒng)計學劑量，以每單位實驗動物體重接受的受試物重量（mg/kg）來表示。3.8限度劑量limitdose受試物給予的劑量上限（2000mg/kg或5000mg/kg）。3.9垂死狀態(tài)moribundstatus試驗動物處于臨死狀態(tài)或即使接受治療也不能存活的狀態(tài)。3.10名義試驗動物量nominalsamplesize名義試驗動物量可用兩種方法計算：染毒序列開始時出現相似效應的動物數量減1得到一個數量，再用試驗動物的總數減去這個數量即為名義試驗動物量；或者，記錄結局第一次發(fā)生相反的一對動物的數量，用試驗動物的總數減去一個比該數量小（不含本數）的值，即可得到名義試驗動物量。例如，在一個模型序列OOOXXOXO中，X和O表示動物的相反結局（如X表示在48小時內死亡，O表示存活）。此時，試驗動物的總數量（或傳統(tǒng)意義的樣本容量）是8，名義試驗動物量是6。在這個例子中，有4只動物發(fā)生相反。必須注意文件中某一特定部分中的數量是指名義試驗動物量還是試驗動物總數。例如，最大試驗動物數量是15。當以最大試驗動物數量終止試驗時，名義試驗動物量將小于或等于15。名義試驗動物量是從第（r-1）個動物開始（出現相反對的第二只動物前的那一只）（3.13）?？深A測的死亡predictabledeath通過臨床表現可以預測在試驗結束前的某個時間會發(fā)生死亡，如：不能喝水或進食。概率積分變換probit對劑量（通常以對數表示）來說，效應服從標準正態(tài)分布（即以平均值為對稱軸，以標準差σ調節(jié)曲線形狀）。劑量-效應模型經概率積分變換后，可視為以σ的倒數為斜率的直線。致死量的標準正態(tài)分布是對稱的，所以其平均值即為LD50，也可理解為中位響應。33.13相反reversal是指一種現象，即在某個染毒劑量下沒有觀測出試驗動物的毒性效應，在下一個染毒劑量下試驗動物表現出效應；反之亦然（也就是前一個動物表現出效應，后一個動物無效應）。相反結果是由一對組成。發(fā)生第一次相反結果的動物以r-1和r編號。標準差standarddeviation(σ)是一個正態(tài)對數曲線的標準差，該曲線描述的是試驗動物對化學品染毒的承受范圍（如染毒劑量超過試驗動物的承受限，試驗動物就可能表現出毒性效應）。估值σ反映了試驗動物在整個染毒劑量區(qū)間內效應的變動性。見斜率和概率。3.15斜率（劑量-反應曲線）slope（ofthedose-responsecurve）是劑量-效應曲線與劑量主軸所形成的角度值。如果以概率作為度量尺度與染毒劑量對數進行概率分析時是正態(tài)分布，那么劑量-效應曲線將會是一條直線，且斜率是σ（試驗動物染毒承受力的標準偏差）。見概率和σ。3.16終止規(guī)則stoppingrule本文件中所用的終止規(guī)則在以下情況是同義的：1）一個具體的終止判定依據；2）用來確定測試序列何時終止的規(guī)則的匯集。特別是進行正式試驗時，終止規(guī)則作為一個快速判定依據使用，通過比率與臨界值的比較結果來決定是否終止試驗。4試驗原則4.1一般原則試驗之前應綜合考慮可獲得的受試物所有可用信息，包括受試物的名稱和化學結構，物理化學性質，受試物的任何體外或體內毒性試驗結果;結構相似物質或混合物的毒理學數據，以及受試物的預期用途。這些信息有助于推斷毒性試驗在人體健康和環(huán)境保護方面的相關性，也有助于選擇合適的起始劑量。本方法允許使用置信區(qū)間對LD50進行評估，根據《全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度》中化學品的分類標準，依據這些試驗結果可以對具有急性毒性的物質進行定級和分類。計算機模擬結果表明，當沒有無數據可用于LD50和劑量-效應曲線斜率的初步估算時，以175mg/kg劑量附近開始，利用劑量的半對數單位（對應劑量級數因子3.2）估算，可以得到最好的結果。如果受試物是高毒性，則應對該起始劑量進行修正。釆用半對數間距可以更高效地使用動物，也可以增加預測LD50的準確性。由于本方法對起始劑量有偏差，故初始劑量的選取一定要低于LD50的估值。然而，與其他急性毒性測試方法相似，對可變性大的受試物（即劑量-效應曲線斜率?。┲滤绖┝康墓浪氵€是會引入偏差，且LD50會有一個大的統(tǒng)計誤差。針對估算值的特性，本文件在主要試驗部分介紹了一項停止規(guī)則以對其進行校正（見5.3.2.2.3）。計算機可確立試驗順序并提供估值，這簡化了逐個動物間的計算。如果已知受試物在某個劑量下因腐蝕或嚴重刺激而導致明顯疼痛，則不需要對其進行試驗。瀕臨死亡的動物、明顯疼痛的動物、或表現出嚴重且持久痛苦的動物，應予以人道處死，在分析試驗結果時應將其視為于試驗中死亡的動物。限度試驗可有效識別可能具有低毒性的化學品。4GB/T21826—××××4.2限度試驗原理限度試驗是一項連續(xù)的試驗，動物最大使用量是5只。試驗使用的劑量可為2000mg/kg，特殊情況下也可為5000mg/kg。使用2000mg/kg和5000mg/kg的試驗過程略有差別（見5.3.2.1.1和5.3.2.1.2）。當受試物的LD50接近限度劑量時，進行連續(xù)試驗計劃可以增加統(tǒng)計的有效性，但可能會向不進行限度試驗的情況偏離；即出現方法安全性的問題。正如任何的限度試驗，當真實LD50非常接近限度劑量時，可能會降低對受試物進行正確的分類。4.3正式試驗原理4.3.1正式試驗是由一個單一次序的劑量級數組成，一次使用一只動物，每次至少要間隔48h。按照低于最佳估算LD50一級的劑量給第一只動物染毒。如果試驗動物存活，便使用最初劑量3.2倍的劑量給第二只動物染毒；如果第一只試驗動物死亡，第二只動物就要接受較低的劑量，劑量級數同上面相似（3.2是一個默認的劑量級數因子，對應于一個半對數單位的劑量級數，5.3.2.2.2提供了劑量級數因子的選擇）。對每只動物都應認真觀察至48h后，才能決定是否對下一只動物染毒及確定染毒劑量。該決定取決于48h觀察期滿時動物的生存狀況（見5.3.2.2.1和5.3.2.2.5中劑量間隔的選擇）。使用停止原則可以使試驗動物數量維持在較低水平（見5.3.2.2.4），調整染毒劑量模式可以降低較差的起始劑量值或較低的斜率造成的影響。當滿足這些停止原則時，染毒就要停止（見5.3.2.2.3和6.2.1），這時，基于終止時所有動物的試驗情況，就可以對LD50和置信區(qū)間進行評估。在大多數情況下，動物實驗結果中出現第一對相反后，試驗僅需4只動物就可完成。釆用最大似然法對LD50進行計算（見6.2.1和6.2.3）。4.3.2計算的過程以主要試驗得到的結果作為起點，給出一個可信的置信區(qū)間評估。置信區(qū)間CI的介5試驗方法5.1試驗動物5.1.1動物選擇5.1.1.1嚙齒類動物首選大鼠，但也可選用其他嚙齒類動物。通常選用雌性大鼠，因為在傳統(tǒng)LD50試驗相關的文獻中，性別間的敏感性幾乎不存在差異；即使觀測出性別差異，雌性大鼠通常也是較敏感的。但是，若結構特性相關化學品的毒理學或毒代動力學數據顯示雄性動物可能更敏感，則應選用雄性動物進行試驗。當用雄性動物做試驗時，應提供充分的理由。5.1.1.2試驗應選用年輕的健康成年動物，雌性動物應非經產、未受孕。在試驗開始時，每只動物應該在8周齡~12周齡，其體重差異不應超過試驗前試驗動物平均體重的20%。5.1.2飼養(yǎng)條件動物房的溫度應控制在22°C(±3°C）。動物房清潔期間除外，相對濕度應控制在30%~70%，最好控制在50%~60%。應釆用人工照明，保持12h光照和12h黑暗交替。染毒48h后，除非同籠動物接觸會因毒性反應增加動物應激反應，否則動物不應單籠飼養(yǎng)，即使單籠飼養(yǎng)，出于動物福利的考慮，宜適時減少單籠飼養(yǎng)時長。采用常規(guī)嚙齒類動物飼料喂食，自由飲水。5.1.3動物準備隨機選擇動物并進行標號，以便于個體識別，染毒前至少提前5d將動物置于試驗籠中飼養(yǎng)，使其適應試驗條件。如果進行連續(xù)的試驗，應確保整個研究中動物體重和周齡的適用性。5.2受試物配制一般情況下，不同劑量應使用相同的受試物給予體積，通過調節(jié)受試物濃度配制所需劑量的試驗溶液。但如果受試物是液體或混合物，應使用不稀釋的受試物（即恒定濃度），因其既適用于后續(xù)的風險評估，又滿足一些監(jiān)管機構的要求。在任何情況下，都不能超過最大染毒體積。液體的每次最大染毒體積取決于試驗動物的大小。對嚙齒類動物而言，體積一般不超過1mL/100g體重；如果是水溶液，可以5使用2mL/100g體重。建議受試物盡可能溶解在水中，或制成懸浮液或乳狀液，其次考慮用油（如玉米油最后再選擇其他賦形劑。當選用非水賦形劑時，應了解所用賦形劑的毒理特性。受試物應在毒性試驗前現用現配，除非已知在配制過程中受試物在賦形劑中的穩(wěn)定性，且可以接受其狀態(tài)。5.3試驗步驟5.3.1染毒5.3.1.1使用胃管或合適的插管對動物進行灌喂染毒。如果非正常情況下，未能一次染毒，也可在24h內分段多次染毒。5.3.1.2動物在染毒前應禁食（如，大鼠應禁食過夜不禁水；小鼠在染毒前禁食3h～4h不禁水）。禁食后對動物稱重，然后再進行染毒。根據禁食后的動物體重來計算染毒劑量。染毒后大鼠要禁食3h～4h，小鼠為1h～2h。當染毒分多次進行時，根據染毒時間段的長短來保障動物飼料和水供應。5.3.2限度試驗和正式試驗如果相關的資料表明受試物可能無毒，即低于管控限度劑量，則可以進行限度試驗。受試物的毒性信息可以通過結構相似化合物、混合物及產品的毒性信息來獲得。當缺少或者無受試物的毒性信息時，或推測出受試物有毒時，應進行正式試驗。5.3.2.1限度試驗5.3.2.1.12000mg/kg劑量限度試驗先對一只動物進行染毒。如果動物出現死亡，則進行正式試驗并計算LD50。如果動物存活，依次對另外4只動物進行染毒，共對5只動物進行試驗。如果有3只動物出現死亡，限度試驗停止，進行正式試驗。如果3只或3只以上動物存活，那么LD50大于2000mg/kg。如果試驗中一只動物出現非預期延遲死亡，而其他動物存活，此時要停止染毒并觀察所有的動物，看其它動物在相同的觀察周期是否也會出現死亡（見5.3.2.2中初始觀察期）。延遲死亡的動物應同其它死亡的動物一樣記入死亡數量。結果評估如下（O=存活，X＝死亡）?！?只或3只以上動物出現死亡，LD50低于限量劑量（2000mg/kg）。OXOXXOOXXXOXXOXOXXX如果有3只動物出現死亡，則進行正式試驗?！獪y試5只動物。當3只或3只以上動物存活，則LD50高于限度劑量（2000mg/kg）。OOOOOOOOXOOOOOXOOOXXOXOXOOXOOO/XOOXXOOOXOO/XOXXOO5.3.2.1.25000mg/kg劑量限度試驗如管理特殊要求，可進行5000mg/kg限度試驗（見附錄C）。出于動物福利的考慮，不鼓勵對GHS第5類（2000mg/kg~5000mg/kg）中的物質進行動物試驗，只有當試驗結果極可能涉及人類或動物健康以及環(huán)境保護等時，方考慮進行該試驗。對一只動物用5000mg/kg劑量進行染毒，如果動物死亡，就進行正式試驗來確定LD50。如果動物存活，繼續(xù)對另外兩只動物進行染毒。如果兩只動物都存活，則LD50高于限度劑量，限度試驗結束（即持續(xù)觀察14d，不對另外的動物進行染毒）。如果一只或者兩只動物出現死亡那么再給另外兩只動物依次染毒。如果試驗中有一只動物出現意外的延遲死亡且有其他動物存活，此時應停止染毒并觀察所有的動物，看其他動物在相同的觀察周期6GB/T21826—××××是否也會死亡。延遲死亡的動物應同其他死亡的一樣記入死亡數量。結果評估如下（O=存活，X=死亡，U=不必要）?！?只或更多的動物死亡，LD50低于限量劑量（5000mg/kg）。OXOXXOOXXXOXXOXOXXX——當3只或更多的動物存活，LD50高于限量劑量（5000mg/kg）。OOOOXOXOOXOO-OOXXOOOXOOXXOO5.3.2.2正式試驗5.3.2.2.1通常每間隔48h對動物染毒一次，一次染毒一只動物。然而，染毒間隔的設置是由發(fā)作、持續(xù)時長和中毒癥狀的嚴重性共同決定的。應當確認先前染毒的動物仍然存活，方可進行下一個劑量的染毒。不確定會產生何種效應時，染毒間隔時間可做適當的調整。當連續(xù)染毒過程中的染毒間隔固定時，試驗較易進行。如果試驗中的染毒間隔時間是變化的，則不必要重新計算染毒劑量和概率比率。為了選擇起始劑量，所有可得到的資料，包括受試物結構相似物質的信息以及受試物的所有毒性測試結果，都應用于估算LD50和劑量-效應曲線的斜率。5.3.2.2.2第一只動物的染毒劑量要比LD50的最佳預測值低一級。如果這只動物存活，便使用較高的劑量給第二只動物染毒。如果第一只動物出現死亡或者垂死的狀況，那么就用較低的劑量對第二只動物進行染毒。劑量級數因子應該選擇為1/（劑量-效應曲線斜率的估計值）的反對數，而且在整個測試中應該保持不變（級數3.2對應的斜率為2）。當沒有受試物的斜率信息時，使用的劑量級數因子為3.2。使用默認的級數因子，染毒劑量依次為1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、2000mg/kg（或者特殊情況下使用1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、1750mg/kg、5000mg/kg的序列進行試驗）。如果無法預測受試物的致死量信息，染毒劑量應當從175mg/kg開始。大多數的情況下，這個劑量是亞致死量，所以釆用此劑量可以減少動物的疼痛和痛苦程度。如果動物對化學品的耐受程度存在較大可變性（即斜率估計值低于2.0），在開始測試前應考慮在劑量對數值上增加0.5（即3.2級數因子）。類似地，對于已知斜率很陡的受試物，應選取比默認值小的劑量級數因子。（附錄A包含了一個劑量級數表，起始劑量為175mg/kg，斜率范圍在1~8之間）。5.3.2.2.3是否繼續(xù)進行染毒，取決于固定時間間隔（如48h）后所有動物的試驗結果。當符合以下任一項時，試驗終止：a）在上限劑量時有連續(xù)3只動物存活；b）在連續(xù)測試的任意6只動物中有5個相反現象發(fā)生；c）至少有4只動物跟隨第一個相反現象，并且確定的概率比率超過臨界值（見6.2.4和附錄B。在試驗進行到第一個相反現象后的第4只動物時，要對每一次染毒劑量進行計算）。對于LD50和斜率變化很大的受試物，試驗出現相反后有4到6只動物跟隨第一個相反現象即可滿足終止規(guī)則c）。在一些情況下，對于劑量-效應曲線斜率較小的受試物，可能需要更多的動物（試驗動物總數最多可達15）。5.3.2.2.4當符合終止規(guī)則時，根據6.1和6.2.1的試驗結果計算LD50。5.3.2.2.5人道處死的垂死動物視同試驗中死亡。如果試驗中一只動物發(fā)生延遲死亡，并且其他服用同等或更多劑量的動物仍存活，應停止染毒，并觀察所有動物，看其他動物是否會在相似的觀察期內死亡。如果后來存活的動物同樣死亡，且所有劑量水平可能都超過LD50，則此時建議重新開始試驗，所用起始劑量至少低于最低的死亡劑量的兩級（并延長觀察時間），因為當起始劑量低于LD50時，方法是最準確的。如果后續(xù)服用與之前死亡的動物同等或更多劑量的動物能夠存活，就不需要改變劑量級數，因為死亡動物的信息將會作為比存活動物更低劑量的死亡率包含到計算中去，而不是后來的存活動物里，這會使LD50降低。5.4觀察75.4.1染毒后30min內至少觀察一次實驗動物，前24h內要定期觀察（染毒后4h內要特別注意），之后14d內每天觀察一次，除非發(fā)現動物死亡或者進行人道處死。但觀察期限并非固定不變，應根據動物毒性反應大小、毒性反應時間以及恢復期時長等因素來決定，如有必要可延長觀察期。毒性癥狀出現和消失的時間應重點觀察，尤其是遲發(fā)性毒性癥狀。系統(tǒng)記錄每只動物的觀察結果。5.4.2如果動物連續(xù)出現毒性癥狀，需進行額外觀察。臨床觀察包括皮膚、被毛、眼、黏膜、呼吸、循環(huán)、植物神經和中樞神經系統(tǒng)，活動和行為特征的改變。應重點觀察震顫、驚厥、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。如發(fā)現動物處于瀕死狀態(tài)，或動物表現出劇烈疼痛或持續(xù)嚴重痛苦癥狀，應對其進行人道處死。當動物被人道處死或者被發(fā)現死亡時，應盡可能精確地記錄死亡時間。5.5體重應在給予受試物前對動物個體稱重，之后應至少每周稱重一次。記錄和計算體重的變化。在試驗結束時存活動物應在稱重后人道處死。5.6病理學所有的動物（包括在試驗期死亡及人道處死）都應進行大體剖檢。記錄每只動物的大體病理變化。在首次染毒后存活24h或更長時間的動物可以考慮對其進行組織病理學檢查，以獲得更多有用的信息。6數據和報告6.1數據應提供動物個體數據。以表格匯總所有試驗數據，包括每個劑量組使用的動物數量、出現毒性癥狀的動物數量、試驗中死亡或人道處死的動物數量，動物個體的死亡時間，毒性效應及相反效應的描述和過程，以及大體解剖結果。同時提供選擇起始劑量和劑量級數的依據。6.2正式試驗LD50計算6.2.1除了6.2.2描述的特殊情況以外，采用最大似然法計算LD50。下列統(tǒng)計學詳細資料有助于最大似然法計算（用假設σ)。無論是直接死亡、遲發(fā)性死亡或人道處死，都包含在最大似然法分析的目標函數中。似然函數見式（1）~（3）：L=L1L2 Ln.......................................................................................（1）如果第i個動物存活，Li=1-F（Zi）或 （2）如果第i個動物死亡，Li=F（Zi） 式中：L——試驗結果的似然值；n——試驗動物的總數；F——標準累積正態(tài)分布；Zi——[log（di）-μ]/σ;di——第i個動物的染毒劑量。μ和σ為給定,σ為標準偏差。真實LD50的估算值由似然值L取最大值時的μ計算得到（見6.2.3）。σ的估計值一般為0.5，除非能夠得到一個較好的一般性或特殊情況的數據。6.2.2在某些情況下，不能進行統(tǒng)計計算或有可能得出錯誤結果。出現以下情況時可以通過特殊方法確定LD50的估算值：a）如果試驗基于5.3.2.2.3中的a即重復進行上限劑量試驗）停止，或者因上限劑量停止試驗，LD50則高于上限劑量值。分類也在此基礎上完成。b）如果所有死亡動物的染毒劑量都比所有存活動物高（或者所有存活動物的染毒劑量比所有死亡動物的高，雖然這幾乎是不可能的），則LD50介于存活動物染毒劑量和死亡動物染毒劑量之間。這些觀察結果不能進一步給出LD50的準確信息。盡管如此，假設給定σ值，則可以計算出最大似然LD50。5.3.2.2.3的b）對這種情況進行了描述。c）如果存活和死亡的動物所使用的染毒劑量只有一個是相同的，并且其他的死亡動物都使用更高的染毒劑量而其他存活動物都使用更低的染毒劑量，或者出現相反的情況，則LD50等于相同的那個染毒劑量。如果受試物是一個與之非常接近的相關物質，應該使用一個較小的染毒劑量級數進行試驗。8GB/T21826—××××如果上述情況都不出現，則LD50應用最大似然法進行計算。6.2.3最大似然計算可以釆用SAS（如非線性回歸分析統(tǒng)計程序PROCNLIN）或統(tǒng)計軟件BMDP（如AR程序）的計算程序包（這些計算程序包在參考文獻[1]的附錄1D中有描述）?；蚴褂闷渌挠嬎丬浖?。ASTME1163—1987的附錄對這些程序作了特殊說明（BASIC程序使用的σ值需要進行校正）。程序得到的結果是logLD50估算值及其標準誤差。6.2.45.3.2.2.3中的c）是基于試驗程序的三次試驗，以表格的形式列出不同μ值時6.2.1的似然性結果。當第6只動物已經不能滿足5.3.2.2.3中a）或b）時，對之后的每個動物試驗進行對比。標準似然性比率方程列于附錄B中。這些對比以自動化方式利用電子數據表軟件很容易完成并可以重復進行，如附錄B中提到計算機軟件。如果符合標準規(guī)則，試驗停止，可用最大似然性方法即可計算出LD50。6.3置信區(qū)間的估算6.3.1根據正式試驗和LD50估計值的計算，可以得出LD50的置信區(qū)間。任何一個置信區(qū)間都可以在正式試驗的可靠性和實用性方面提供有價值的信息。一個寬的置信區(qū)間表明LD50估計值有較多的不確定性。LD50估計值的可靠性低時，其有效性也就低。一個窄的置信區(qū)間表明LD50估計值有較小的不確定性。LD50估計值可靠性高，其有效性也就高。這就意味著，如果重復進行正式試驗，那么新的LD50估計值應與原來的LD50估計值接近，并且這兩個LD50估計值都會接近真實LD50。6.3.2根據正式試驗結果，計算出真實LD50的兩個不同類型置信區(qū)間中的其中一個?！斨辽俨捎萌N染毒劑量進行試驗，且以中間劑量染毒時至少有一個動物存活和一個動物死亡，此條件下，可以用一個似然性的計算機程序得到一個置信區(qū)間，即真實LD50的95%置信區(qū)間。但由于希 望使用少量的動物進行試驗，實際置信水平一般不準確。使用隨機停止規(guī)則改善了應對條件發(fā)生變化的能力，但同時會導致報道的置信水平與真實置信水平存在稍許差別?！绻袆游镌谀骋蝗径緞┝炕虻陀谠搫┝克綍r存活，且所有動物在下一個較高染毒劑量下死亡，則可以計算出一個區(qū)間，下限為所有動物存活時的最高染毒劑量，上限為所有動物死亡時的染毒劑量。這個區(qū)間標注為“大約”，即這個區(qū)間的準確置信水平不能明確確定。由于這種類型的效應僅發(fā)生在劑量-效應曲線斜率陡峭的情況下，而在大多數情況下，真實的LD50應落在所得置信區(qū)間內或與置信區(qū)間非常接近。這個區(qū)間可能相對較窄，且在大多數的實際使用中十分準確。6.3.3在某些情況下，所得置信區(qū)間為無窮大，此時以零作為它的下限，無窮大作為它的上限，或兩者兼而有之。例如，當所有動物死亡或所有動物存活時，可能會得到此類置信區(qū)間。本流程需要專門的計算方法，可使用美國環(huán)保局或經合組織提供的專門程序，或者使用美國環(huán)保局或經合組織提供的技術性細節(jié)資料。資料中描述的這些置信區(qū)間的覆蓋情況和專用程序的性能，同樣也可以通過美國環(huán)保局獲得。6.4試驗報告報告的內容應包括以下的信息：6.4.1受試物6.4.1.1物理性質、純度等相關的物理化學性質（包括異構體）；6.4.1.2標識資料，包括CAS號。6.4.2賦形劑如果賦形劑不是水，注明賦形劑的選擇理由。6.4.3試驗動物6.4.3.1所用動物品系；6.4.3.2動物的微生物狀況（如已知）；6.4.3.3動物數量、鼠齡和性別（包括使用雄性代替雌性的理由）；6.4.3.4供應商、飼養(yǎng)條件與飼料等。6.4.4試驗條件6.4.4.1起始劑量選擇的依據，劑量級數因子以及后續(xù)的劑量水平；6.4.4.2受試物的配描述，包括染毒時物理形態(tài)；6.4.4.3受試物的染毒體積和染毒時間；6.4.4.4飼料和水質的詳細資料（包括飼料類型、飼料來源和水源）。6.4.5結果6.4.5.1體重及體重變化；96.4.5.2以表格的形式列出每只動物的劑量水平和效應數據（即動物出現的毒性癥狀，包括特征、嚴重程度、效應持續(xù)時間和死亡率）；6.4.5.3染毒時的動物個體的體重，每周體重，以及死亡及處死時的體重；6.4.5.4每只動物出現毒性癥狀的時間進程及癥狀是否可逆；6.4.5.5每只動物的大體解剖發(fā)現和組織病理學結果（如果有）；6.4.5.6LD50值；6.4.5.7統(tǒng)計學結果（使用的計算機程序描述和電子數據表格的計算）。6.4.6結果的討論和分析6.4.7結論GB/T21826—××××（規(guī)范性附錄）染毒過程A.1主要試驗的染毒劑量序列A.1.1上下增減劑量法：對每一序列，給動物逐只染毒，通常間隔48h。第一只動物接受的劑量比LD50最佳估計值低一個級數。這個選擇反映了一個調整趨勢，使偏差朝著偏向初始劑量、偏離LD50的方向移動。為之后的每只動物調整劑量，以確保全部試驗的結果穩(wěn)定。以下內容為劑量范圍的選取提供了更多的指導。A.1.2默認劑量級數：一旦確定了初始劑量和劑量間隔，毒理學家就應該列出所有可能的劑量，包括上限（通常是2000mg/kg或5000mg/kg）。接近上限的劑量應從劑量級數中剔除。本文件的本意是提供初始的幾個劑量，形成可自我調整的劑量序列。鑒于試驗易出現正偏差，所以在對物質毫無所知的情況下，建議以175mg/kg為初始劑量。如果主要試驗中采用了默認流程，測初始劑量應該為175mg/kg，劑量級數因子應該取對數計算的默認值0.5。劑量的使用應包含1.75mg/kg、5.5mg/kg、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、2000mg/kg或有特殊需要時應包含1.75mg/kg、5.5mg/kg,、17.5mg/kg、55mg/kg、175mg/kg、550mg/kg、1750mg/kg、5000mg/kg。對于某些高毒性的物質，染毒劑量要向低值移動。A.1.3表A.1提供了劑量級數為整數倍數的斜率（1~8），此時的劑量級數因子不是默認值。表A.1劑量序列單位為毫克每千克斜率＝123456780.175*0.175*0.175*0.3750.175*0.310.175*0.2750.440.175*0.260.3750.175*0.240.340.470.175*0.230.310.410.550.810.550.990.690.550.820.650.910.550.730.973.12.752.61.752.43.41.752.33.15.53.755.54.46.93.755.54.76.54.15.57.3表A.1劑量序列（續(xù)）單位為毫克每千克斜率＝156788.18.29.99.19.727.517.517.537.54437.5474169658182999197275260240230310375440375340470310410550550690550650550730810990820910970240023003100275026003750340031005000a如果需要較低500050005000的劑量，將序列延續(xù)至較低的劑量。50005000500041005000GB/T21826—××××（資料性附錄）似然比終止規(guī)則的估算B.1正式試驗可能以三項終止規(guī)則（見5.3.2.2.2）中的第一項為基礎完成。但無論如何，即使不滿足任意一項停止規(guī)則，只要已對15個動物進行了有效染毒，染毒也應當停止。表B.1~表B.4列舉了缺失受試物信息的例子，此情況下推薦使用默認的起始劑量為175mg/kg，默認的劑量級數因子為3.2或一個半對數。請注意這些表格的內容僅是作為例證。B.2表B.1顯示，在限度劑量2000mg/kg下，如果3個動物存活，正式試驗將如何停止。表B.2顯示，在限度劑量為5000mg/kg下的類似情形（這些都是限度試驗不適用的情況）。表B.3舉出了一個特殊的序列，其中6個試驗動物中出現了5個相反，然后結束試驗。最后，表B.4舉例說明這樣一個情況：當試驗結果既不滿足終止規(guī)則a）也不滿足終止規(guī)則b），且連續(xù)4個試驗動物出現了相反反應，則應評估終止規(guī)則c）。B.3終止規(guī)則c）需要在每個動物測試后用似然比終止規(guī)則對其進行評估，從出現相反后的第四個動物開始。推測出三個“試驗程序方法”。技術上來說，這些程序方法是可能的，如推薦的LD50的最大似然評估方法。這個程序接近于以概率為基礎的置信區(qū)間的計算。B.4程序的基礎是：當已經收集到了足夠的數據時，LD50點估計比偏離點估計的值更加可靠,此時需要用概率對點估計的可靠性進行量化。因此要計算三個概率值：一個是數值剛好為LD50點估計的概率（例子中稱為粗略估值或平均劑量估值），一個是數值低于點估計的概率，一個是數值高于點估計的概率。具體地，低數值為點估計除以2.5的商，高數值為點估計的2.5倍。B.5通過似然性比率的計算來比較似然值，然后判斷這些似然性比率（LR）是否超過一個臨界值。當點估計的似然性比率超過其他每個似然性2.5步進因子時，停止試驗，該因子可表示點估計在統(tǒng)計學上有相對強的可靠性。因此計算兩個似然比率，一個是點估計與點估計除以2.5的商的似然比率，一個是點估計與點估計乘2.5的積的似然比率。B.6LD50值的計算用任何帶有正態(tài)概率函數功能的電子制表軟件均可完成。附錄B中表B.4所舉的LD50的例子就是模仿電子制表軟件構建出來的。表B.4以極限劑量上限5000mg/kg為例介紹了計算步驟，上限劑量為2000mg/kg時計算步驟相同?；蛘?，使用具有數據輸入、公式運算功能的，軟件，從OECD和USEPA網站上直接下載動物數據，輸入LD50估算公式和置信區(qū)間計算公式后進行計算。表B.5給岀了這類軟件的截圖。B.7上限劑量為5000mg/kg的虛擬范例（見表B.4）在這個虛擬例子中，限度劑量為5000mg/kg，在試驗完9個動物后滿足了似然比停止規(guī)則。第3個動物試驗時出現了第一次“相反”。當試驗完“相反”后的4個動物時要檢查似然比終止規(guī)則是否滿足。在這個例子中，相反后的第4個動物即為實際試驗中的第7個動物。因此，對于這個例子來說，電子制表軟件的計算僅需要從第7個動物進行試驗后開始，同時進行數據輸入。隨后，在第7個動物、第8個動物和第9個動物試驗后也要進行似然比終止規(guī)則的檢查。此例中，在第9個動物試驗完后首次滿足了似然比終止規(guī)則?！来屋斎朊恐粍游锏膭┝?效應信息。第1欄步驟編號為1~15。試驗動物最多為15只。第2欄每一個接受試驗的動物在該欄標記為I。第3欄輸入第i個動物的染毒劑量。第4欄注明動物反應狀況：有效應（標記為X），無效應（標記為O）?！x和實際試驗動物量名義試驗動物量由第一次相反的兩只動物（這里是第2只和第3只動物）加上后來接受試驗的所有動物組成。第5欄列出了每只動物是否記入名義試驗動物量中。第16行給出了名義試驗動物量（n）。這是名義試驗動物的數量。在這個例子里，n為8。第17行為實際試驗動物的數量。——LD50的粗略估值記入名義試驗動物量中的動物，其染毒劑量幾何平均值用于LD50粗略估值的計算。在表中，稱之為“平均劑量估值”。它隨著每只接受試驗的動物而更新。為了允許選擇一個較差的初始測試劑量，該平均值要限于名義動物數量中，它可以產生一個初始的效應群和一個初始的非效應群。（但是，下面最終LD50的似然性計算中用到的是所有的動物數量）?；貞浺幌?，n個數量的幾何平均數是n個數量的1/n次方的產物。第18行為平均劑量估計值［例如,（175×55O×…×175O）1/8＝1292.78］第19行為第18行值的對數（10為底例如log101292.8＝3.112)?！狶D50粗略估值似然性似然性是一個統(tǒng)計學方法，用來量度數據對LD50或其他參數的估計值的支持程度。似然性比率可用于比較數據對于不同的LD50估計值的可靠程度。第8欄按LD50的粗略估值計算LD50平均估計值的似然性。該似然性（第21行）是分布到各只動物上的似然性的總和（見6.2.1）。每只動物上的似然性分布用Li表示。在第7欄中輸入各反應劑量di的概率估計值，記作Pi。Pi從劑量-效應曲線計算得出。注意：概率積分變換劑量-效應曲線的參數是斜率和LD50，所以需要這些參數的數值。第18行的平均劑量估值用于LD50的估算。這個例子中的斜率使用默認值2。利用下面列出的步驟計算反應概率Pi。a）計算lgdi（第6欄）。），Zi=(lgdi–lgLD50)/σc）第i個劑量的估計反應概率為Pi=F(Zi)），統(tǒng)計表中的函數F（或相似函數）用于正態(tài)第8欄:計算了似然性分布的自然對數InLi。Li僅僅是實際觀察到的每只動物的效應的概率：表現出效應的動物：InLi=lnPi無效應的動物：InLi=ln（1-Pi）注意這里用的是自然對數（In），而其他地方（通常）用的是以10為底的對數。這些選擇通常是由上下文來預測的。每只動物都要完成上述步驟。最后：第20行：第8欄對數-似然性分布求和。第21行：對第20行的可能性貢獻的log值進行exp函數計算。(如exp（-3.389）=e-3.389=0.0337)?！嬎鉒D50的粗略估值的上下兩種劑量的似然性如果可以精確估計數據，對偏離估計值LD50較遠的值的似然性而言，合理的LD50估計值將會有高的似然性。比較平均劑量估值的似然性（1292.8，第18行）和以2.5階數因子發(fā)生變化的值（即到1292.8×2.5和1292.8/2.5）。計算同上面描述的類似（列于第9~12欄中除了517.1（=1292.8/2.5）和3232.0（=1292.8×2.5）替代1292.8用于LD50的估計。——計算似然性比率GB/T21826—××××——確定似然比是否超過臨界值高似然比意味著對LD50估計值的高度可靠性。上述兩個似然比計算結果（4.21和3.44）都超出GB/T21826—××××表格B.1劑量為2000mg/kg時，終止規(guī)則a）范例級數（I）包含劑量（X）效應（O）無效應是否屬于名義動物數量劑量的常用對數值LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!效應概率似然性分配（InLi）效應概率似然性分配（InLi）效應概率似然性 分配（InLi）OK1IO否2.2430#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!2I550O否2.7404#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!3I2000O否3.3010#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!4I2000O否3.3010#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!5I2000O否3.3010#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!6E-------7E-------8E-------9E-------E-------E-------E-----E-----E-----E-------名義試驗動物實際試驗動物量=量=05計算的LD50的最大似然估計值=無GB/T21826—××××表格B.2劑量為5000mg/kg時，終止規(guī)則a）范例級數（I）包含（E）不包含劑量（X）反應（O）沒反應是否屬于名義動物數量劑量的常用對數值LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!LD50=#DIV/0!效應概率似然性分配（InLi）效應概率似然性分配（InLi）效應概率似然性 分配（InLi）OK1IO否2.2430#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!2I550O否2.7404#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!3IO否3.2430#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!4I5000O否3.6990#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!#DIV/0!5I5000O否3.699