外來入侵昆蟲種類的分子鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了外來入侵昆蟲的田間調(diào)查、取樣和分子鑒定等要求。本文件適用于外來入侵昆蟲種類的分子鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅對該日期對應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T1876醫(yī)用媒介生物標(biāo)本采集、制作及保存規(guī)程SN/T2752.4衛(wèi)生檢疫人員的自我防護(hù)規(guī)范第4部分：實(shí)驗(yàn)室人員SN/T4278國境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲DNA條形碼鑒定操作規(guī)程WS/T230臨床診斷中聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1COⅠ基因COⅠgeneCOⅠ基因即線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ基因(CytochromecoxidaseI,COI)，它的突變速度較核DNA快，使物種分離更為準(zhǔn)確，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失,使序列比對容易操作，可應(yīng)用于相近物種鑒定。3.2ITS2基因ITS2geneITS2基因核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2，變異速度適中，能夠提供較豐富的變異位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，位于5.8S與28S之間，可應(yīng)用于種團(tuán)、復(fù)合體之間進(jìn)行鑒定。方法原理基于線粒體COⅠ基因序列對外來入侵害蟲進(jìn)行鑒定，確定種內(nèi)差異、種間差異，結(jié)合核糖體ITS2基因?qū)ΨN團(tuán)、復(fù)合組進(jìn)行鑒定。儀器設(shè)備、試劑與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備5.1儀器設(shè)備生物安全柜、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、微量分光光度儀、PCR儀、電泳設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)等。5.2主要試劑動物組織基因組DNA提取試劑盒、PCRPremix、超純水、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)（DL2000）。5.3實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室生物安全符合GB19489和SN/T2752.4的規(guī)定；PCR防污染措施遵照WS/T230的要求執(zhí)行。鑒定方法6.1取樣標(biāo)本樣品經(jīng)過冷凍或乙醚麻醉，死后取成批同種樣品的單份標(biāo)本、珍稀單份標(biāo)本取對稱一側(cè)組織（如單側(cè)昆蟲足）置于滅菌的潔凈1.5mL離心管留用，如長期不用需放置體積分?jǐn)?shù)為90%以上乙醇-20℃保存。標(biāo)本的其他同種個體或部分針插為憑證標(biāo)本。6.2憑證標(biāo)本制作將取樣后的標(biāo)本制作成憑證標(biāo)本，標(biāo)本的制作按照SN/T1876的要求執(zhí)行。6.3DNA制備將單份樣品（成蟲、幼蟲、蛹）置于滅菌的潔凈1.5mL離心管后用研磨棒研磨，利用商品化昆蟲DNA提取試劑盒進(jìn)行昆蟲基因組提取（樣品為單只昆蟲的，可去掉頭部后再研磨）；樣品為少量對稱一側(cè)組織（單側(cè)蟲足）置于滅菌的潔凈1.5mL離心管后用研磨棒研磨，利用微量組織DNA提取方法（見附錄A）進(jìn)行昆蟲基因組的制備，制備好的DNA進(jìn)行濃度及純度測定后，保存至-20℃冰箱備用。6.4COⅠ序列擴(kuò)增利用通用引物進(jìn)行COⅠ序列擴(kuò)增（見附錄B）、測序，測序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行比對（見附錄C）。6.5ITS2序列擴(kuò)增根據(jù)序列COⅠ結(jié)果鑒定困難的，同時屬于同一種團(tuán)、復(fù)合組目錄（見附錄D）中的昆蟲種類可以通過ITS2通用引物進(jìn)行擴(kuò)增（見附錄E）、測序，測序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行比對（見附錄C）。6.6結(jié)果判定COⅠ序列長度電泳條帶在750bp左右，ITS2序列長度電泳條帶在500bp左右，在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行比對，若與數(shù)據(jù)庫中昆蟲種序列同源性大于等于98%，則判定該昆蟲種和數(shù)據(jù)庫中的昆蟲種為同一種。也可以在BOLD比對，具體按SN/T4278規(guī)定執(zhí)行。6.7樣本保藏對同一批中相同形態(tài)特征的昆蟲種數(shù)量較多的情況下，除了作為核酸提取的標(biāo)本外，其他根據(jù)SN/T1876進(jìn)行標(biāo)本制作和保存，提取后核酸和擴(kuò)增產(chǎn)物除一部分測序外，剩下的分別做好標(biāo)記并保存與-80℃超低溫冰箱作為憑證樣本，以便復(fù)核。

附錄A（資料性）微量組織DNA提取方法A.1配置裂解液配置100mL裂解液（10mmol/LTris-HClPH8.0，1mmol/LEDTA，1%NonidetP-40，100ug/mL蛋白酶K）。A.2熱裂解吸取35μL兒裂解液，加樣勻漿，加35μLddH2O，煮沸5min。A.3離心10000r/min離心10min，取上清備用。

附錄B（規(guī)范性）COⅠ序列擴(kuò)增流程B.1引物序列LCO-1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′、HCO-2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′B.2PCR體系推薦用50μL體系，引物濃度為10μM，模板可用提取的昆蟲DNA10-100ng，可用商品化的PCRmix。B.3擴(kuò)增程序第一步：94℃5min；第二步：95℃30s，46℃30s，72℃40s，35個循環(huán)；第三步：72℃7min。B.4電泳及測序5μLPCR產(chǎn)物，質(zhì)量濃度為1.5%瓊脂糖，PCR產(chǎn)物大?。杭s750bp。測序引物為LCO-1490或HCO-2198，雙向測序。

附錄C（資料性）序列比對C.1進(jìn)入網(wǎng)站/，進(jìn)入網(wǎng)站主頁；C.2點(diǎn)擊BLAST，選擇NucleotideBLASTC.3提交序列輸入序列，點(diǎn)擊BLAST，提交鑒定。附錄D（資料性）陜西省常見的外來入侵物種中文名拉丁學(xué)名西花薊馬Frankliniellaoccidentalis南美斑潛蠅Liriomyzahuidobrensis美洲斑潛蠅Liriomyzasativae苜蓿籽蜂Bruchophagusgibbus煙粉虱Tobaccowhitefly二斑葉螨Tetranychusurticae番茄潛葉蛾Tutaabsoluta

附錄E（資料性）ITS2基因擴(kuò)增程序E1.引物序列ITS2F5′-TGTGAACTGCAGGACACATG-3′-ITS2R5′-AATGCTTAAATTTAGGGGGTA-3′E2.PCR體系及擴(kuò)增程序推薦用50μL體系，引物濃度為10μM，模板可用提取的昆蟲DNA10-100ng，可用商品化的PCRmix。E.