DB21DB21/T2549—2015仔豬乳糖酶基因檢測技術(shù)規(guī)程Methodofdetectinglactasegeneinpiglets2015—12—15發(fā)布2016—02—15實施遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布1本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：田玉民、蘇玉虹、朱弘焱、陶曉2本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了仔豬乳糖酶基因啟動子和增強(qiáng)子多態(tài)性的檢測條件、檢測步驟和結(jié)果判定的技術(shù)要件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試GB/T27476.1-2014檢測實驗室安全收。仔豬的乳糖酶基因位于染色體15q13，預(yù)測CDS全長為5793bp，在基3——上游引物F：5'-AAAAAGTTTGGTAAGGACCT-——下游引物R：5'-GGAACTGTTAGGAGGTATGTG-3'——上游引物F：5'-TAAACAAAGCCAAGGACATT-——下游引物R：5'-CTGGGGTGTATGTGCTTGTGG-3'微量移液器、高速冷凍離心機(jī)、核酸蛋白測定儀、PCR熱循環(huán)儀、pH計、精度0.1g分析天平、渦用豬耳號鉗子夾取仔豬耳部邊緣組織0.5cm3，立即置采用常規(guī)的酚-三氯甲烷法提取，并測定DNA溶液濃度。具體方法板的PCR反應(yīng)作為陰性對照）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為318bp。用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAEx用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.Analysis和Sequencher軟件包進(jìn)行測序峰圖的多重比對和對多態(tài)性位點的判7.4乳糖酶基因5'UTR區(qū)增強(qiáng)子SNPG-4加滅菌雙蒸水至15μL。可根據(jù)需要調(diào)整反應(yīng)體系（注：為保證實驗準(zhǔn)確性，需設(shè)置以板的PCR反應(yīng)作為陰性對照）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAEx用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.Analysis和Sequencher軟件包進(jìn)行測序峰圖的多重比對和對多態(tài)性位點的判8結(jié)果判定8.1啟動子SNPG-308C和A-301G因GA，基因型為純合子GAGA；如果測序結(jié)果僅有等8.2增強(qiáng)子SNPG-797A基因如果測序結(jié)果僅有等位基因A，基因型為純合子AA；如果9廢棄物處理550mmol/LTris-HCl,50mmol/LNa2EDTA，SDS3024:1(體積比)4mmol/LMgCl26B.1組織消化B.2DNA提取DNA提取方法：l)棄上清液，使管內(nèi)酒精揮發(fā)干凈；根據(jù)沉淀情況加入適量（建議40μL）TB.3DNA含量的測定c=A×N×50/1000N——核酸稀釋倍數(shù)。A