DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病IDB37/T3128.1—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、竇硯國、鄭肖強(qiáng)。1DB37/T3128.1—2018l群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了I群禽腺病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。熒光試驗(yàn)(IFA)適用于上述病毒的檢測、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)適用于對I群禽腺病毒12種血清型病毒的鑒定。下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫下列定義和術(shù)語適用于本文件。種血清型。3.2間接免疫熒光試驗(yàn)Indirect用對應(yīng)某一種抗原的抗體(這里被稱為一抗)與細(xì)胞孵育結(jié)合，在采用對應(yīng)一抗(也就是抗一抗)的抗體(這里被稱為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子)與細(xì)胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光信號為陽性反應(yīng)。3.3利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，用于檢測DNA序列多態(tài)性。3.42雞胚肝癌上皮細(xì)胞系，來源于雄性雞肝臟腫瘤。電泳檢測區(qū)，盡可能形成有效的物理隔離，且為單一流向，不得倒流。用收集處，并通過適當(dāng)?shù)姆绞?如焚燒、或送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司)進(jìn)行無害化處理。用垃圾處理公司做最終處理。4.2人員操作人員應(yīng)接受實(shí)驗(yàn)室生物安全、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理、細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)培訓(xùn)。熟悉生物樣品處理、細(xì)胞培養(yǎng)、以及核酸提取、基因擴(kuò)增等分子生物學(xué)技術(shù)。a)生物安全柜；b)PCR儀；c)CO?恒溫培養(yǎng)箱(37℃恒溫);d)臺式低溫高速離心機(jī)(最大轉(zhuǎn)速12000r/min);e)電泳儀；j)微量移液器(最大量程分別為10μL、20μL、100μL、1000μL),帶濾芯的槍頭；k)孵化器(37℃恒溫);n)電磁爐或微波爐；除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。b)細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%血清的DMEM培養(yǎng)基);c)細(xì)胞維持液(含1%血清的DMEM培養(yǎng)基);d)甲醇：丙酮(1:1)固定液；e)抗體稀釋液PBST,見A.2;3f)商品化的FITC標(biāo)記鼠抗兔熒光抗體；g)兔抗I群禽腺病毒多克隆抗體(滅活疫苗免疫兔制備);m)商品化的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，要求在100bp～2000bp之間，有5條以上的指示條帶；o)1×TAE緩沖液，見B.2;q)核酸電泳加樣緩沖液，見B.4;y)Hexon基因擴(kuò)增引物。FAV-AF:5'-TGGACATGGGGGCGACCTA-3';FAV-BF:5'-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3';5.2.1室溫條件下樣品在1h~2h內(nèi)處理完畢，未能及時(shí)處理的樣本在4℃冰箱中存放，不超過24h;也可于-20℃低溫條件下保存，不超過30d;-70℃貯存最佳，不超過1年。5.2.2組織研磨液和泄殖腔拭子懸液置于-20℃低溫條件下保存，不超過2周；-70℃貯存不超過5.3.1在生物安全柜中，取1IU/mL)等滲磷酸鹽緩沖液(PBS,pH值7.0~7.4,附錄A.1)配成10%～20%(g/mL)的懸液；泄殖腔拭子懸液中抗生素濃度提高5倍。加入抗生素后pH調(diào)至7.0～7.4。4DB37/T3128.1—20185.3.35.3.3樣本組織懸液反復(fù)凍融3次，經(jīng)8000r/min離心10min,取上清并置4℃過夜，次日接種SPF雞胚或LMH細(xì)胞系。6.1雞胚接種6.1.1將處理后的樣品上清，每份尿囊腔接種(3枚~5枚)9日齡~11日齡SPF雞胚，0.2mL/胚，置于孵化器中，37℃孵化120h。6.1.2棄去24h內(nèi)死亡胚，24h~120h內(nèi)死亡和存活雞胚置4℃冰箱過夜或-20℃冷凍1h,分別無菌收集尿囊液并進(jìn)行無菌檢查，無菌尿囊液盲傳三代。6.2細(xì)胞接種6.2.1將處理后的樣品上清接種單層LMH細(xì)胞，孵育1h,吸棄上清，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次，吸棄后加入細(xì)胞維持液。6.2.270%以上單層細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)物凍融后，轉(zhuǎn)移至凍存管置于-70℃保存，不超過3年。7.1間接免疫熒光法(IFA)緩沖液輕輕洗滌3次~4次，吸棄液體。每孔加入用-20℃預(yù)冷的甲醇：丙酮(1:1)固定液150μL,置于-20℃孵育10min,吸棄固定液。干燥后用PBS緩沖液洗滌7.1.2一抗孵育用抗體稀釋液(PBST,見附錄A.2)將兔抗工群禽腺病毒多克隆抗體作1:200倍稀釋，每孔加入100μL,置于濕盒中，37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。7.1.3二抗孵育避光條件下，用PBST將FITC標(biāo)記鼠抗兔抗體作1:200倍稀釋，每孔加入100μL,置于濕盒中，37℃孵育1h。吸棄后用PBS洗滌3次。7.1.4封片觀察加入數(shù)滴50%甘油(附錄A.3)封片，置于熒光倒置熒光顯微鏡(FITC熒光目鏡)下，觀察是否出現(xiàn)綠色熒光信號。7.2限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析7.2.1DNA的提取510×PCRBuffer2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上游引物(50μmol/L)和下游引物(50當(dāng)加樣緩沖液中溴酚藍(lán)電泳過半至凝膠下2/5處時(shí)，停止電泳。將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀下觀按照瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書對陽性條帶回收、純化，溶解于30μLddH20中。測定核酸濃度，確保核酸濃度≥10ng/μL。反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物(片段A或B)17μL、10×緩沖液2μL、HaeⅡ限制性內(nèi)切酶1μL,總體積為20μL。反應(yīng)條件：37℃孵育1h,72℃作用5min。取酶切產(chǎn)物9μL,按照7.2.4的步驟進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。7.2.11對照設(shè)置每次檢測，用相應(yīng)的陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品(LMH細(xì)胞),至少設(shè)置一個(gè)或一個(gè)以上的8結(jié)果判定8.1LMH細(xì)胞感染I群禽腺病毒，細(xì)胞腫脹變圓，呈葡萄串狀，細(xì)胞間隙增大，IFA檢測出現(xiàn)綠色熒光信號。在陽性對照出現(xiàn)綠色熒光信號，陰性對照無條帶出現(xiàn)(引物二聚體除外)時(shí)，檢測樣品陽性的表明樣品中存在I群禽腺病毒，陰性樣品中無I群禽腺病毒。68.2陽性對照接種細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，IFA檢測顯示胞漿出現(xiàn)綠色熒光信號(附錄C),陰性對照無細(xì)胞病變，胞漿未出現(xiàn)綠色熒光信號時(shí)，判定檢測有效；否則判定檢測結(jié)果無效，陽性樣品用于病毒的血清型鑒定。8.3以陽性樣品培養(yǎng)物的