ICS71.100.70

CCSY40

FJCA

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/FJCA003—2024

特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)試秀麗線(xiàn)

蟲(chóng)法

SpecialfoodsandcosmeticsLipidregulationtestCaenorhabdiformismethod

（征求意見(jiàn)稿）

在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專(zhuān)利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

??福建省特殊食品與化妝品協(xié)會(huì)發(fā)布

T/FJCA003—2024

特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)試秀麗線(xiàn)蟲(chóng)法

1范圍

本文件規(guī)定了運(yùn)用秀麗線(xiàn)蟲(chóng)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“線(xiàn)蟲(chóng)”）評(píng)價(jià)特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)測(cè)試的方法。

本文件適用于特殊食品和化妝品脂質(zhì)調(diào)節(jié)功能的測(cè)試，特殊食品和化妝品的原料可參考本方法。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

DB35/T2132—2023實(shí)驗(yàn)用秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)飼育技術(shù)

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1線(xiàn)蟲(chóng)生命周期LifeCycleofC.elegans

20℃標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件下，線(xiàn)蟲(chóng)從受精卵發(fā)育為成蟲(chóng)僅需84h左右，途中經(jīng)歷14h的胚胎發(fā)育期，而后

分別在受精后大約第26h、33h、41h、51h進(jìn)行連續(xù)的幾次蛻皮，經(jīng)過(guò)L1期、L2期、L3期、L4期四個(gè)

幼蟲(chóng)階段發(fā)育為成蟲(chóng)。在L4期蛻皮后約12h，進(jìn)入產(chǎn)卵生殖期。在生殖期之后，線(xiàn)蟲(chóng)可以再存活14d～

21d。見(jiàn)附錄A。

3.2大腸埃希氏菌OP50EscherichiacoliOP50（E.coliOP50）

尿嘧啶缺陷型大腸桿菌。

4檢測(cè)原理

油紅O是一種脂溶性二唑染料，可與線(xiàn)蟲(chóng)的中性脂質(zhì)和膽固醇酯特異性結(jié)合，使這些脂肪著色。線(xiàn)

蟲(chóng)大部分脂肪儲(chǔ)存在腸道和皮膚樣的表皮細(xì)胞中，且由于線(xiàn)蟲(chóng)身體是透明的，因此可以通過(guò)觀測(cè)油紅O

在線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的著色水平來(lái)判斷秀麗線(xiàn)蟲(chóng)脂肪含量，著色大/色深代表油脂含量越多。利用ImageJ軟件

處理線(xiàn)蟲(chóng)的油紅著色樣圖即可對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪累積和分布進(jìn)行定量。

5材料與試劑

5.1材料

——秀麗線(xiàn)蟲(chóng)（Caenorhabditiselegans)、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌（EscherichiacoliOP50,E.coli

OP50）

——挑蟲(chóng)器

——培養(yǎng)皿

5.2試劑

除非另有說(shuō)明，化學(xué)試劑使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?。配制方法?jiàn)附錄B及DB35/T2132—2023。

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油紅O（C26H24N4O）、氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4）、氯化鉀（KCl）、

磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醇、膽固醇、瓊脂

粉（Agar）、LB肉湯、蛋白胨、異丙醇、TritonX-100、PBS緩沖液。

5.3陽(yáng)性對(duì)照品

奧利司他標(biāo)準(zhǔn)品（Orlistat），純度≥98％，CAS：96829-58-2

6實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

——體視顯微鏡，放大倍數(shù)在5倍～50倍之間；

——恒溫培養(yǎng)箱，精度±1℃；

——潔凈工作臺(tái)；

——萬(wàn)分之一天平，精度0.1mg；

——高壓滅菌鍋；

——高速離心機(jī)；

——恒溫?fù)u床；

——旋轉(zhuǎn)混勻儀；

——光學(xué)顯微鏡，物鏡變倍不小于10倍。

7實(shí)驗(yàn)步驟

7.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

繁殖期（4d齡）線(xiàn)蟲(chóng)，用于線(xiàn)蟲(chóng)的同期化。線(xiàn)蟲(chóng)的培養(yǎng)基維護(hù)應(yīng)按照DB35/T2132—2023的方法執(zhí)

行。

7.2受試物

受試物包含特殊食品和化妝品及其原料。配制受試物測(cè)試溶液時(shí)，若受試物為水溶性物質(zhì)，則使用

無(wú)菌雙蒸水作為溶劑，若受試物為非水溶性物質(zhì)，可選用二甲基亞砜（DMSO）或納米乳液等作為溶劑。

針對(duì)不同受試物，需結(jié)合其特性調(diào)整前處理方法。

7.3NGM平板的制備

7.3.1測(cè)試樣品NGM的配制

測(cè)試樣品NGM的配制如下：

——水溶性樣品：

空白對(duì)照組：用移液槍吸取150μL的E.coliOP50菌液輕輕地打在NGM板的中央，避光晾

干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品組：將受試樣品溶解在無(wú)菌雙蒸水中制成一定濃度的母液，取樣品母液分別同熔融

的NGM及E.coliOP50菌液按一定比例混合均勻，將含有一定濃度的NGM加入6cm培養(yǎng)皿

中，待冷卻凝固后，用移液槍吸取150μL含有相對(duì)應(yīng)樣品濃度的E.coliOP50菌液打在NGM

板的中央，避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

——非水溶性樣品

空白對(duì)照組：取E.coliOP50菌液和樣品溶劑按照和樣品組同樣的稀釋比例混合均勻，用移

液槍吸取150μL的混合液打在NGM板的中央，避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品組：將受試樣品溶解在DMSO或納米乳劑中制成一定濃度的母液，取樣品母液分別同

熔融的NGM及E.coliOP50菌液按一定比例混合均勻，將含有一定濃度的NGM加入6cm培

養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，用移液槍吸取150μL含有相對(duì)應(yīng)樣品濃度的E.coliOP50菌液打在

NGM板的中央，避光晾干后封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

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7.3.2陽(yáng)性對(duì)照組

陽(yáng)性對(duì)照奧利司他組：用DMSO配制成6mg/mL母液，取奧利司他母液分別同熔融的NGM及E.coli

OP50菌液按999:1比例混合均勻，將奧利司他終濃度為6μg/mL的NGM加入6cm培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固

后，用移液槍吸取150μL奧利司他終濃度為6μg/mL的E.coliOP50菌液打在NGM板的中央，避光晾干后

封膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8實(shí)驗(yàn)方法

8.1線(xiàn)蟲(chóng)同期化及測(cè)試實(shí)驗(yàn)

挑取L4時(shí)期的線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至OP50-NGM培養(yǎng)皿中，每皿放置30～50只，在20℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d后（4d

齡），挑取20只至各實(shí)驗(yàn)NGM平板中，產(chǎn)卵1h，而后將母蟲(chóng)盡數(shù)挑出。20℃培養(yǎng)3d，最后收集培養(yǎng)好

的線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行油紅O染色。

8.2油紅O染色

用1.5mL的PBST緩沖液將NGM板上的線(xiàn)蟲(chóng)沖洗轉(zhuǎn)移至無(wú)菌2mL離心管中，在2000rpm轉(zhuǎn)速下離心

1min，棄上清，加1.5mL的PBST緩沖液沖洗線(xiàn)蟲(chóng)并在同樣條件下離心2次，棄上清。加入600μL的40％

異丙醇，在旋轉(zhuǎn)混勻儀中，30rpm旋轉(zhuǎn)3min，棄上清，再加入600μL的油紅染液，在旋轉(zhuǎn)混勻儀中，

30rpm旋轉(zhuǎn)2h。棄上清，加入600μL的PBST緩沖液，在旋轉(zhuǎn)混勻儀中，30rpm旋轉(zhuǎn)30min，棄上清，

余下50μL含線(xiàn)蟲(chóng)的緩沖液，用于圖像的拍攝及脂質(zhì)的定量分析。

8.3圖像拍攝及脂質(zhì)的定量分析

取10μL待檢的線(xiàn)蟲(chóng)緩沖液，滴加至載玻片中央，蓋上蓋玻片。在光學(xué)顯微鏡100×放大倍數(shù)下拍攝

線(xiàn)蟲(chóng)圖像，并使用ImageJ2軟件對(duì)圖像中線(xiàn)蟲(chóng)紅色的脂質(zhì)進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行隨

機(jī)挑選至少10只線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行拍攝分析。

9結(jié)果評(píng)價(jià)

9.1統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用ImageJ2軟件對(duì)圖像中線(xiàn)蟲(chóng)紅色的脂質(zhì)進(jìn)行定量分析，得到總強(qiáng)度值（分析方法見(jiàn)附錄C）。

采用GraphPadPrism8軟件繪制柱狀圖并分析t-test分析間差異，P＜0.05表示有顯著性的差異。線(xiàn)蟲(chóng)體脂

抑制率計(jì)算見(jiàn)公式。

··················································(1)

TI

式中：IL=(1?CI)×100%

IL——脂質(zhì)抑制率（InhibitionRateofLipid）

CI——空白對(duì)照組平均總強(qiáng)度值（IntensityofBlankControl）

TI——樣品組平均總強(qiáng)度值

9.2結(jié)果判定及說(shuō)明

在實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)足有效性的基礎(chǔ)上，樣品組線(xiàn)蟲(chóng)的總強(qiáng)度值顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明樣品

在該濃度下具有減少線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪的能力。

在同一批次實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)比較不同樣品的線(xiàn)蟲(chóng)體脂抑制率來(lái)判定其減脂功效的強(qiáng)弱。

10實(shí)驗(yàn)有效性的條件

10.1樣本量

3

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最終用于脂質(zhì)定量分析的單組實(shí)驗(yàn)線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量不少于30條。

10.2孵化率

線(xiàn)蟲(chóng)的孵化率不低于95％。

10.3陽(yáng)性對(duì)照

奧利司他陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)與空白對(duì)照組應(yīng)具有顯著性差異（如附錄D所示）。

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A

A

附錄A

（資料性）

線(xiàn)蟲(chóng)生命周期

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B

B

附錄B

（資料性）

培養(yǎng)基及試劑配制

B.1PBST緩沖液

1×PBS緩沖液100mL，10μL的TritonX-100，混勻。

B.2油紅O染液

36mg油紅O加入18mL異丙醇，混勻；再加入12mL的雙蒸水，混勻。

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C

C

附錄C

（資料性）

ImageJ2測(cè)定線(xiàn)蟲(chóng)紅色脂質(zhì)總強(qiáng)度的方法

ImageJ2軟件下載地址：/Fiji/Downloads

1)在ImageJ2軟件中打開(kāi)圖像（File–Open–SelectFile–Open）；

2)選擇多邊形工具（菜單欄左至右第三個(gè)繪圖工具），在圖像上完整地勾勒出線(xiàn)蟲(chóng)的輪廓，

點(diǎn)擊窗口Edit-ClearOutside

3)調(diào)整顏色的閾值（Image-Adust-ColorThreshold），將Colorspace選擇為RGB格式，調(diào)

節(jié)Red通道的亮度和對(duì)比度的值（同一批次實(shí)驗(yàn)均采