流式細胞儀工作原理

流式細胞分析分選原理流式細胞術的原理流式細胞術（FCM）是一種能對單個細胞、分子和生物顆粒（微生物）進行多參數(shù)快速檢測的新型分析和分選技術。近幾年隨著多種單克隆抗體的成功制備和多種熒光素的應用。FCM逐步運用于對疾病診斷和治療監(jiān)測的臨床檢驗常規(guī)工作。流式細胞分析分選原理流式細胞儀與顯微鏡光源激光自然光、燈光、氙(汞)燈對象細胞、生物粒子細胞、生物粒子承載工具載(蓋)玻片鞘液及流動室檢測信號光學信號形態(tài)及染色放大方式PMT，放大電路目鏡X物鏡統(tǒng)計人工，200計算機，>5000結(jié)果簡單，單參數(shù)多參數(shù)，綜合分析流式細胞分析分選原理基本原理流路流動室 鞘液SHEATH樣本流SAMPLE單細胞懸液5*105~1*106個/ml光路光源檢測信號光電倍增管PMTHV電路放大電路HV及GAIN增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計：計算機流式細胞分析分選原理流式細胞儀光路流路電子軟件流式細胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細胞分析分選原理流路單細胞懸液大多數(shù)儀器是在50-300μm大小的孔徑中,將細胞懸液注射進入鞘液中這一過程,成為流體動力學聚焦流式細胞分析分選原理FLOWCELLInjector

TipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheath

fluid流式細胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細胞分析分選原理光路光源檢測信號散射光信號

FS:前向角散射光

SS:側(cè)向角散射光(90度散射光)熒光信號 熒光染料 光學濾片

顏色補償流式細胞分析分選原理光路光源 與通過的細胞聚焦在同一點上激光 空冷 488nmblue,633nmred,325nmUV,514nmgreen,水冷Innova300系列 Innova70系列固態(tài)流式細胞分析分選原理檢測信號流式細胞分析分選原理

散射光信號—前向散射光(FS)FSForward

(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FS的強度與細胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關FS用于檢測細胞或其他粒子的表面屬性 如:大小流式細胞分析分選原理前向散射光流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理散射光信號–側(cè)向散射光SS-Side

(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器,也稱為90度散射光檢測器

SS的強度與細胞或其他顆粒的大小,形狀及opticalhomogeneity有關SS用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比流式細胞分析分選原理側(cè)向散射光流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理90DegreeScatter02004006008001000815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSideScatterProjectionLightScatterGatingScale流式細胞分析分選原理光路-熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.利用各種不同波長的光學濾片來收集(檢測)這些光學信號流式細胞分析分選原理熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)流式細胞分析分選原理Fluorescenceemittedbyeachfluorochromeisusuallydetectedinauniquefluorescencechannel.Thespecificityofdetectioniscontrolledbythewavelengthselectivityofopticalfiltersandmirrors.流式細胞分析分選原理Absorptionspectrum:RangeoverwhichafluorescencecompoundmaybeexcitedEmissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound流式細胞分析分選原理5ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5/PC7流式細胞分析分選原理4ColorSingleLaser(488nm)

FITC/PE/ECD/PC5流式細胞分析分選原理常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC633 670流式細胞分析分選原理光路-濾片特性當以45o

角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光

這種方式的濾片稱為二向色性濾片(dichroicfilter)

流式細胞分析分選原理標準帶通濾片bandpass光源通過的光譜630/30nmBP615-645nmlight

流式細胞分析分選原理SourcelightPassedlightCertaincolorsabsorbedAbsorbancefilter流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理488DL488BK550DL525BP600DL575BP640DL620BP675BP流式細胞分析分選原理Unique4-ColorSingleLaserDesignAir-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL流式細胞分析分選原理PC7Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(RD1)675BP(PC5)750BPFL4(PC7)488DL488BK550DL600DL700DL流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理WithThankstoDr.FrankSchniedersGentherapieGruppe–AbteilungMolekulareZellbiologieInstitutfürMedizinischeBiochemieundMolekularbiologieUniversit?tsklinikumHamburg-EppendorfEGFP,EYFPand7-AADWithEPICS?XLTMandEXPO32TMADC-SoftwareHEK293HumanEmbryonalKidneyCells293FilterSetBP510LAF21BP550LAF30DichroicMirror525DRLPCellViabilitywith7-AADHEK293-cellswithEYFPTransfectionHEK293-cellswithEGFPTransfectionMixtureofEGFP-andEYFP-transfectedHEK293-CellsEGFP...EnhancedGreenFluorescentProtein(Ex488;Em507nm)EYFP...EnhancedYellowFluorescentProtein(Ex513;Em527nm)7-AAD...7-Aminoactinomycin(ViabilityStain;Ex546;Em647nm)流式細胞分析分選原理emissionintensitywavelengthFLBFLA顏色補償流式細胞分析分選原理減法顏色補償減法補償去除疊加信號,在使用雙色以上時會產(chǎn)生減得過多的錯誤BDFACSCalibur補償試劑FITCPECorrectOver-compFITCPEUnder-compFITCPE流式細胞分析分選原理全矩陣顏色補償全矩陣在每個PMT上對于每一個熒光計算“疊加熒光素”的比率通過矩陣去除或加上信號EPICSXLCytomicsFC500Gallios/NaviosCD45-ECD流式細胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細胞分析分選原理電路及電子系統(tǒng)-光電倍增管Photomultipliertube(PMT)

將光學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字數(shù)據(jù))信號

流式細胞分析分選原理不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程

流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理單參數(shù)直方圖流式細胞分析分選原理流式細胞分析分選原理流路光路電路/電子軟件流式細胞分析分選原理軟件基于Windows平臺軟件界面簡單，易學易用目前流式獲取和分析最友好的軟件包，涵蓋所有數(shù)據(jù)和圖形處理功能易于與醫(yī)院內(nèi)LIS系統(tǒng)相連直觀拖拽方式調(diào)節(jié)電壓、補償，支持時時/自動/脫機補償支持多文件分析報告，內(nèi)置FlowPage功能，方便中文臨床報告的生成和輸出PRISM濃縮柱形圖功能便于結(jié)果統(tǒng)計，兼容Office，支持PDF內(nèi)置質(zhì)控功能流式細胞分析分選原理Quickset——直觀的電壓調(diào)節(jié)流式細胞分析分選原理QuickComp——直觀的補償調(diào)節(jié)補償前補償后流式細胞分析分選原理PRISM濃縮柱形圖

一張圖上顯示多達1024個表型組合結(jié)果（十色分析，210分析組合）將實驗所分析的所有細胞數(shù)據(jù)結(jié)果簡單地濃縮在一張直方圖上能直接讀出各種陰性或陽性組合的結(jié)果清晰直觀且便于數(shù)據(jù)的保存顏色點圖組合21223323462451025615267212