諾如病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)

及其質(zhì)量控制山東省疾病預(yù)防控制中心病原微生物所張文強(qiáng)

一、諾如病毒簡(jiǎn)介二、實(shí)時(shí)定量PCR原理三、諾如病毒實(shí)時(shí)定量RT-PCR四、質(zhì)量控制目錄諾如病毒簡(jiǎn)介1940s,胃腸炎糞便過(guò)濾,接種，志愿者發(fā)病1968年,美國(guó)，諾瓦克鎮(zhèn)小學(xué)暴發(fā)急性胃腸炎1972年，電鏡，諾瓦克病毒/小圓結(jié)構(gòu)病毒1992年，全基因組序列，杯狀病毒科2002年8月，ICTV,諾如病毒歷史諾如病毒基因組結(jié)構(gòu)和編碼蛋白諾如病毒的結(jié)構(gòu)諾如病毒進(jìn)化快抗原變異重組引起人類(lèi)腹瀉的主要是GⅠ和GⅡ聚合酶區(qū)分類(lèi)實(shí)時(shí)定量PCR原理PCR-體外模擬人體DNA復(fù)制PCR循環(huán)、擴(kuò)增在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的累積，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR-起點(diǎn)定量，“天然”普通PCR技術(shù)-終點(diǎn)定量，“加工”

實(shí)時(shí)定量PCR熒光擴(kuò)增曲線-不是嚴(yán)格遵從2n擴(kuò)增終點(diǎn)定量失真基線：擴(kuò)增曲線最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，直線區(qū)域基線閾值

Ct值[DNA]0閾值：人為設(shè)定，基線熒光標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍Ct值：熒光信號(hào)到達(dá)域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)基線

閾值

Ct值

[DNA]0Ct值-起始DNA量數(shù)的對(duì)數(shù)：線性關(guān)系基線

閾值

Ct值

[DNA]0Ct值[DNA]0，Why？Ct值[DNA]0，Why？諾如病毒實(shí)時(shí)定量RT-PCR諾如病毒檢測(cè)方法人工合成的寡核苷酸鏈5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)（Reporter，R）3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，Q）與目標(biāo)序列互補(bǔ)TaqMan探針

新DNA鏈切斷探針熒光信號(hào)熒光信號(hào)的累計(jì)與PCR產(chǎn)物形成完全同步TaqMan探針?lè)磻?yīng)原理優(yōu)點(diǎn)：特異性高，可用于多重PCR體系缺點(diǎn)：成本高，設(shè)計(jì)困難，多重PCR探針的選擇雙重檢測(cè)，ORF1-ORF2交界區(qū)引物和探針

反應(yīng)體系熱循環(huán)程序

Genogroup（G）引物/探針序列（5'to3'）工作濃度GICog1FCGYTGGATGCGITTYCATGA400nMCog1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400nMprobeRing1EFAM–TGGACAGGRGAYCGC–MGBNFQ200nMGIICog2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG400nMCog2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400nMprobeRing2Cy5–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQ2200nM組分體積（μL）終濃度2×RT-PCRbuffer12.51×Cog1F（50μM）0.2400nMCog1R（50μM）0.2400nMprobeRing1E（50μM）0.1200nMCog2F（50μM）0.2400nMCog2R（50μM）0.2400nMprobeRing2（50μM）0.1200nM25×RT-PCRenzyme11×RNase-freewater7.5

引物和探針

反應(yīng)體系熱循環(huán)程序

循環(huán)數(shù)溫度時(shí)間145℃10min195℃10min45×95℃15S60℃1min引物和探針

反應(yīng)體系熱循環(huán)程序

諾如病毒檢測(cè)流程實(shí)時(shí)定量PCR操作流程陰性對(duì)照：無(wú)擴(kuò)增，NoCt病毒模板對(duì)照：有擴(kuò)增，曲線與閾值交叉樣本：陽(yáng)性Ct≤40結(jié)果說(shuō)明質(zhì)量控制人數(shù)專(zhuān)業(yè)素養(yǎng)延續(xù)性?xún)x器的熟練使用人員試劑儀器樣本處理室核酸提取室體系配置室加樣室PCR室實(shí)驗(yàn)室分區(qū)采集對(duì)象：病例重點(diǎn)人群水/食物/環(huán)境標(biāo)本類(lèi)型：糞便，5g以上采集時(shí)間：標(biāo)本應(yīng)在發(fā)病5日內(nèi)采集標(biāo)本保存：短期4℃

長(zhǎng)期-20℃或-80攝氏度標(biāo)本運(yùn)輸：冷藏或冷凍標(biāo)本采集專(zhuān)門(mén)的房間RNA酶去除劑操作輕柔PE手套塑料墊消毒劑陰性對(duì)照密封的大便盒

標(biāo)本處理試劑的效期專(zhuān)門(mén)的房間RNA酶去除劑加樣輕柔陰性對(duì)照

核酸提取試劑的效期專(zhuān)門(mén)的房間RNA酶去除劑試劑冰浴MasterMix，分裝陰性對(duì)照體系配置標(biāo)本-槍頭-反應(yīng)孔陽(yáng)性對(duì)照最后加盡量少碰觸管帽離心加樣熒光PCR產(chǎn)物上機(jī)基線閾值陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照Excel電子表格、Excel公式結(jié)果分析標(biāo)準(zhǔn)曲線好的標(biāo)準(zhǔn)曲線：平行樣本曲線聚集；間隔均勻；S型曲線CT值在預(yù)定范圍內(nèi)；Eff在90%~100%間；R2＞0.98差的標(biāo)準(zhǔn)曲線：平行樣本一致性差；間隔不均勻；CT值超出預(yù)定范圍內(nèi)；Eff>110%IPC，人工合成的核苷酸序列，Ct：32-38降低假陰性結(jié)果內(nèi)部陽(yáng)性質(zhì)控（IPC）PCR抑制，病毒陰性W1230028：加樣量15ul，J