泡盛曲霉來源β-1,3-1,4葡聚糖酶的純化、性質及應用研究學生：劉二偉指導老師：朱文學教授

日期：2016.11.122014級研究生開題報告匯報內容1、實驗方法2、實驗結果3、下一步實驗計劃1、實驗方法產(chǎn)β-葡聚糖酶菌株的確定及鑒定液體發(fā)酵條件優(yōu)化搖瓶復篩平板初篩β-葡聚糖酶的純化β-葡聚糖酶的酶學性質β-葡聚糖酶的應用研究實驗路線圖2、實驗結果2.1泡盛曲霉CAU33的分離與鑒定2.2泡盛曲霉CAU33產(chǎn)β-1,3-1,4葡聚糖酶

液體發(fā)酵條件優(yōu)化2.2.1碳源對液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響碳源β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力（U/mL）可溶性淀粉41.5±0.9稻草541.5±22.9玉米桿257.7±17.8玉米芯755.7±52.2小麥麩皮582.1±11.7燕麥粉453.7±16.6葡萄糖28.8±5.3青稞粉681.1±5.32.2.2氮源對液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響氮源種類β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力（U/mL）酵母提取物1817±65胰蛋白胨1896±40酵母提取物：胰蛋白胨=1:12161±51蛋白胨1758±63牛肉蛋白胨2220±84大豆蛋白胨2406±113乙酸銨864±87(NH4)2SO4731±83(NH4)2HPO4457±472.2.3表面活性劑對液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-

葡聚糖酶的影響表面活性劑β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力

（U/mL）02468±72吐溫

202736±56吐溫

402882±105吐溫

603105±163吐溫

803269±61曲拉通

X-1103629±105曲拉通

X-1144071±1592.2.4初始pH和發(fā)酵溫度對液體發(fā)酵產(chǎn)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響2.2.5發(fā)酵時間對液體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-

葡聚糖酶的影響2.2.5響應面法優(yōu)（CCD）化液體發(fā)酵產(chǎn)

β-1,3-1,4-葡聚糖酶試驗號因素酶活(U/mL)A-玉米芯B-大豆蛋白胨C-曲拉通X-114觀測值擬合值100-233983709.19200077107728.52300076097728.52400079517728.525-11-161735871.62620069507402.94711181947750.8781-1-164496037.3791-1164846600.241000073007728.5211-11169847210.491211-172686915.4913-20056335365.1914-1-1154395606.3715-1-1-142824533.991600257375610.941700078647728.521800077527728.521902073927734.69200-2054105252.44中心復合設計(CCD)響應面設計及實驗結果各因素的估計回歸系數(shù)項自由度平方和均方FPr>F模型930124017.573347113.0621.75123218<0.0001A14152425.0634152425.0626.984556530.0004B16161565.0636161565.0640.04096359<0.0001C13616653.0633616653.0623.502839310.0007AB1102831.125102831.1250.6682486170.4327AC1126756.125126756.1250.8237253580.3854BC137128.12537128.1250.2412773190.6339A212840448.3252840448.3218.458668660.0016B212396605.7182396605.7215.57435510.0027C2114795649.4714795649.596.14960738<0.0001剩余101538815.381153881.538失擬51277866.047255573.2094.8969891240.0530回歸5260949.333352189.8667總和1931662832.95

經(jīng)回歸擬合后，酶活的預測值Y可以用以下回三元二次歸方程表示：Y=7728.52+509.44*A+620.56*B+475.44*C-113.37*A*B-125.87*A*C+68.13*B*C-336.11*A2-308.74*B2-767.11*C2R2=95.14%，二次方程的擬合度高，自變量與響應值之間線性關系顯著，說明此模型預測結果比較準確。各因素對β-1,3-1,4葡聚糖酶產(chǎn)量影響的響應面圖和等高圖

優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為：玉米芯55g/L、大豆蛋白胨25g/L、曲拉通X-11423g/L，測定酶活力為8446.93U/mL，比優(yōu)化前提高了17.6倍，且與預測值相近，誤差為2.6%，2.3泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶的純化純化步驟總酶活力(U)總蛋白(mg)比活（U/mg）純化倍數(shù)(fold)回收率（%）粗酶液288729020161432.191100硫酸銨沉淀（60-90%）2142446784.82729.941.974.2Q-Sepharosefastflow（pH8.0）77294071.410825.497.626.7DE52（pH7.0）63809042.315084.869.122.1泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶純化表凝膠層析法測定分子量，測定其分子量為27.6kDa。純化電泳圖2.3.1泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶

最適pH及pH穩(wěn)定性2.3.2泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶

最適溫度及溫度穩(wěn)定性

該酶在45℃，50℃，55℃，60℃，65℃的半衰期分別為277min，200min，57min，32min，26min。2.3.3金屬離子及化合物對泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響金屬離子及化合物相對酶活力（%）比酶活力（Umg-1）Control10015,345±375Cu2+108.316,618±283Ca2+9113,963±149Ni2+111.117,048±591Mg2+120.618506±358Zn2+110.516,956±476Mn2+8613,196±543Co2+109.816,848±173Na+101.715,605±182Ba2+80.112,291±318Hg2+15.12,317±101Fe2+94.214,454±122Fe3+112.717,293±173Cr3+114.617,585±235Sn2+141.921,774±146Li+112.717,294±402K+106.416,327±224SDS84.813,012±236DTT95.714,685±1892.3.4泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶的底物特異性2.3.5泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶在

麥芽糖化中的應用

酶添加量過濾時間過濾時間降低粘度粘度降低（U/g麥芽）（s）百分比(%)(cP)百分比(%)01500-1.599-2014155.671.5761.49