實(shí)驗(yàn)三水及食品中微生物的檢測(cè)生物11趙曉云34號(hào)食品微生物檢驗(yàn)方法為食品監(jiān)測(cè)必不可少的重要組成部分。它不僅是衡量食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否食用的科學(xué)依據(jù)之一。通過(guò)食品微生物檢驗(yàn)，可以判斷食品加工環(huán)境及食品衛(wèi)生環(huán)境,能夠?qū)κ称繁患?xì)菌污染的程度作出正確的評(píng)價(jià)，為各項(xiàng)衛(wèi)生管理工作提供科學(xué)依據(jù),提供傳染病和人類，動(dòng)物和食物中毒的防治措施。食品微生物檢驗(yàn)是以貫徹“預(yù)防為主”的衛(wèi)生方針，可以有效地防止或者減少食物中毒人畜共患病的發(fā)生，保障人民的身體健康；同時(shí)，它對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟(jì)損失，保證出口等方面具有政治上和經(jīng)濟(jì)上的重要意義。大腸菌群是指在37℃條件下24h內(nèi)能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的無(wú)芽孢革蘭陰性桿菌，主要包括腸桿菌科的4個(gè)屬即埃希氏菌屬(Escherichia)、枸櫞酸桿菌屬(Citrobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和腸桿菌屬(Enterobacter)的細(xì)菌。[1]該類細(xì)菌主要來(lái)源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便，故將大腸菌群作為食品被人和溫血?jiǎng)游锛S便污染的指示菌來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量。食品中大腸菌群值的高低，表明該食品被糞便污染的程度，也反映對(duì)人體健康危害性的大小。因此大腸菌群數(shù)常作為飲水、食物或藥物的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。致病性大腸桿菌通過(guò)污染飲水、食品、娛樂(lè)水體引起疾病暴發(fā)流行，病情嚴(yán)重者，可危及生命。1材料與儀器1.1材料樣品：湖水、黃酒。1.2培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基。1.2.1肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水100ml、pH7.2、0.10Mpa滅菌20min。如配制固體培養(yǎng)基需加瓊脂1.5%~2%；如配制半固體培養(yǎng)基則加瓊脂0.7%~0.8%。1.2.2乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基(單料)蛋白胨20g、乳糖10g、豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g、0.04%溴甲酚紫水溶液25ml、蒸餾水1000ml、pH7.4。配制方法如下：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝每10ml，并倒置放入杜氏小管(注意排凈小管內(nèi)氣泡)，115℃1.2.3乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨20g、乳糖10g、0.04%溴甲酚紫水溶液25ml、蒸餾水1000ml、pH7.4。配制時(shí)將蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，按檢驗(yàn)要求分裝30ml、10ml或3ml，并倒置放入杜氏小管(注意排凈小管內(nèi)氣泡)，115℃1.2.4伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基是一種鑒別培養(yǎng)基，常用于食品及飲用水的微生物學(xué)檢驗(yàn)，培養(yǎng)基中的伊紅為酸性燃料，美藍(lán)則為堿性染料，當(dāng)大腸桿菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)生混合酸時(shí)，細(xì)菌帶正電荷，與伊紅染色，再與美藍(lán)結(jié)合生產(chǎn)紫黑色化合物。在此培養(yǎng)基上大腸桿菌生長(zhǎng)形成呈紫黑色帶金屬光澤的小菌落，而產(chǎn)氣桿菌則形成棕色大菌落，不能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌產(chǎn)堿性物質(zhì)較多，帶負(fù)電荷，與美藍(lán)結(jié)合形成蘭色菌落。其配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、20%乳糖溶液20ml、2%伊紅溶液20ml、0.5%美藍(lán)溶液10ml、水1000ml、瓊脂20g、pH7.6。配制時(shí)將牛肉膏、蛋白胨、NaCl加入水中溶解，調(diào)pH為7.6，加瓊脂、融化、分裝、滅菌。再以無(wú)菌操作加入預(yù)先0.075MPa滅菌20min的20%乳糖溶液20ml、2%伊紅溶液20ml、0.5%美藍(lán)溶液10ml。當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到50℃1.3實(shí)驗(yàn)儀器顯微鏡、培養(yǎng)箱、水浴鍋、培養(yǎng)皿、吸管、接種環(huán)、試管、杜氏小管、涂布器、酒精燈、試管架等。實(shí)驗(yàn)方法2.1細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定2.1.1采樣瓶裝發(fā)酵酒的取樣方法：用點(diǎn)燃的酒精棉球灼燒瓶口滅菌，用石炭酸紗布蓋好，再用滅菌開(kāi)瓶器將蓋啟開(kāi)，含有二氧化碳的酒類可倒入500ml滅菌磨口瓶中，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕振蕩，待氣體全部逸出后，進(jìn)行檢驗(yàn)。水樣的采取方法：自來(lái)水應(yīng)先將自來(lái)水龍頭用火焰灼燒3min，再打開(kāi)水龍頭，使水自流5min，用無(wú)菌三角瓶接取水樣，塞上塞子備用。池水、河水或湖水應(yīng)取距水面10~15cm的深層水樣，將無(wú)菌帶玻璃塞的廣口瓶浸入水中，盛滿后將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕觯詈昧⒓礄z驗(yàn)，否則必須放入冰箱中保存。2.1.2檢樣稀釋(無(wú)菌操作)將被檢樣25g(或25ml或1ml)剪碎，放入含有225ml(或9毫升)無(wú)菌生理鹽水(或無(wú)菌水)的無(wú)菌三角瓶(瓶?jī)?nèi)放置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或無(wú)菌研缽內(nèi)，經(jīng)充分振蕩或研磨，制成10-1稀釋液。用1ml吸管吸取10-1稀釋液1ml，沿管臂慢慢注入含有9ml無(wú)菌生理鹽水或無(wú)菌水的試管內(nèi)，制成10-2的稀釋液，同法，直到用最后稀釋度的菌液做傾注法平皿計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)培養(yǎng)皿的菌落數(shù)在30~300之間。2.1.3傾注培養(yǎng)根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)Ρ粰z樣品所含菌體濃度的估計(jì)或通過(guò)預(yù)備實(shí)驗(yàn)，選擇2~3個(gè)適宜稀釋度，從稀釋度最高的懸浮液取1ml放入平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作2~3個(gè)平皿。稀釋液移入平皿后，及時(shí)將保溫至45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或其他細(xì)菌培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并搖動(dòng)平皿使培養(yǎng)基和菌液混勻，待凝固后將平皿倒置于36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)242.1.4菌落計(jì)數(shù)方法可用肉眼觀察直接計(jì)數(shù)，也可用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。2.平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30~300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，取同一稀釋度的2~3個(gè)平板的平均值。若有的平板上有較大片菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2代表整個(gè)平板的菌落數(shù)。稀釋度的選擇參見(jiàn)表1。表1菌落總數(shù)計(jì)算方法報(bào)告方式例子不同稀釋度的平均菌落數(shù)菌落總平均數(shù)及其報(bào)告方式(個(gè)/ml或個(gè)/g)備注10-110-210-3兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比1136516420－16400或1.6×1042多不可計(jì)295461.637750或3.8×1023多不可計(jì)271602.227100或2.7×1044多不可計(jì)1650513—513000或5.1×105527115—270或2.7×1026000—<1×10或<17多不可計(jì)30512—30500或3.1×104首先選擇平均菌落數(shù)在30~300之間的平板，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該稀釋度的平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)進(jìn)行報(bào)告。若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30~300之間，則按兩者菌落總數(shù)之比值來(lái)決定。若其比值小于2，應(yīng)取兩個(gè)稀釋度的平均數(shù)；若大于2，則取其中較少的菌落數(shù)進(jìn)行報(bào)告。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋數(shù)最低的平均菌落數(shù)報(bào)告之。若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300之間，大于300或小于30，則以最接近30或300的菌落數(shù)乘以稀釋度報(bào)告之。菌落數(shù)的報(bào)告：當(dāng)菌落數(shù)在100以內(nèi)時(shí)，按其實(shí)際數(shù)值進(jìn)行報(bào)告；當(dāng)大于100時(shí)，采用兩位有效數(shù)字進(jìn)行報(bào)告，兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入的方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，可用10的指數(shù)來(lái)表示。2.2大腸菌群檢驗(yàn)大腸菌群檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。被檢樣品被檢樣品稀釋稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管36乳糖膽鹽發(fā)酵管36±1℃24±不產(chǎn)氣產(chǎn)氣不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性伊紅美藍(lán)瓊脂平板36大腸菌群陰性伊紅美藍(lán)瓊脂平板36±1℃報(bào)告報(bào)告乳糖發(fā)酵管革蘭氏染色乳糖發(fā)酵管革蘭氏染色不產(chǎn)氣產(chǎn)氣革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌革蘭氏陽(yáng)性不產(chǎn)氣產(chǎn)氣革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌革蘭氏陽(yáng)性大腸菌群陰性大腸菌群陰性大腸菌群陰性大腸菌群陰性大腸菌群陽(yáng)性大腸菌群陽(yáng)性報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告報(bào)告圖1大腸菌群檢驗(yàn)程序2.2.1檢樣稀釋無(wú)菌操作將檢樣25ml(或25g)放入裝有225ml無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或無(wú)菌研缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨制成10-1稀釋度的稀釋液。用1ml無(wú)菌吸管吸取上述稀釋液1ml，注入含有9ml無(wú)菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖混勻，制成10-2的稀釋液。另取1ml無(wú)菌吸管，按上述方法依次做10倍遞增稀釋液，每次換用1支1ml無(wú)菌吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)Ρ粰z樣品污染情況估計(jì)，選擇3個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。2.2.2乳糖膽鹽發(fā)酵[2]將被檢樣品接種乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，每一稀釋度接種3管，置36±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2.2.3分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別接種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1℃復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗(yàn)在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上挑?、僮霞t色，具有金屬光澤的菌落；②深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；③淡紅色，中心較深的菌落。具有以上特征的菌落為可疑大腸菌群菌落，挑取1~2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)對(duì)應(yīng)接種到乳糖發(fā)酵管內(nèi)進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，36±1℃培養(yǎng)24±結(jié)果與分析3.1細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定取湖水、黃酒稀釋度為10-4和10-5的稀釋液于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基內(nèi)混合培養(yǎng)，每一稀釋度2個(gè)平板。結(jié)果如表2，表3所示。根據(jù)菌落技術(shù)報(bào)告中的“④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋數(shù)最低的平均菌落數(shù)報(bào)告之”得，本次實(shí)驗(yàn)中，湖水細(xì)菌總數(shù)（取兩位有效數(shù)字）為0.5×105個(gè)/ml，黃酒細(xì)菌總數(shù)＜1×104個(gè)/ml。表2湖水傾注培養(yǎng)結(jié)果稀釋度菌落數(shù)平皿號(hào)10-410-5備注100201平均00.5表3黃酒傾注培養(yǎng)結(jié)果稀釋度菌落數(shù)平皿號(hào)10-410-5備注100200平均003.2大腸菌群檢驗(yàn)3.2.1分別取黃酒、湖水1、10-1、10-2稀釋液1ml注入乳糖膽鹽發(fā)酵管，每個(gè)稀釋度接種3管，于36±1℃的恒溫箱里倒置培養(yǎng)24±2h，結(jié)果如表4和表5所示。表4湖水乳糖膽鹽發(fā)酵接種量(ml)1號(hào)管2號(hào)管3號(hào)管1產(chǎn)氣產(chǎn)氣產(chǎn)氣0.1產(chǎn)氣產(chǎn)氣產(chǎn)氣0.01產(chǎn)氣產(chǎn)氣產(chǎn)氣表5黃酒乳糖膽鹽發(fā)酵接種量(ml)1號(hào)管2號(hào)管3號(hào)管1不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣0.1不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣0.01不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣不產(chǎn)氣用湖水進(jìn)行乳糖膽鹽發(fā)酵，結(jié)果顯示都產(chǎn)氣、產(chǎn)酸，再將其進(jìn)行分離培養(yǎng)。而用黃酒進(jìn)行乳糖膽鹽發(fā)酵，結(jié)果顯示都不產(chǎn)氣、不產(chǎn)酸，報(bào)告為大腸菌群陰性。3.將產(chǎn)氣的湖水發(fā)酵管分別接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，于36±1℃恒溫箱倒置培養(yǎng)18-24h。觀察菌落形態(tài)。結(jié)果如表6所示。表6湖水伊紅美藍(lán)固體培養(yǎng)基分離培養(yǎng)接種量(ml)1號(hào)管2號(hào)管3號(hào)管1有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落0.1有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落0.01有可疑菌落有可疑菌落有可疑菌落3.2.對(duì)分離培養(yǎng)得到的紫紅色，具金屬光澤的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)對(duì)應(yīng)接種到乳糖發(fā)酵管內(nèi)進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，于36±1℃的恒溫箱倒置培養(yǎng)24±2h，觀察產(chǎn)氣情況。表7湖水革蘭氏染色及乳糖復(fù)發(fā)酵結(jié)果接種量(ml)1號(hào)管2號(hào)管3號(hào)管1G-；產(chǎn)氣G-；產(chǎn)氣G-；產(chǎn)氣0.1G-；產(chǎn)氣G-；產(chǎn)氣G-；產(chǎn)氣0.01G-；產(chǎn)氣G-；產(chǎn)氣G-；產(chǎn)氣結(jié)果如表表7所示，表明所有管均為大腸菌群陽(yáng)性管。查大腸桿菌最可能數(shù)(MPN)檢索表可知，每100ml湖水大腸菌群最可能數(shù)（MPN）超過(guò)24000個(gè)，每100ml黃酒MPN不超過(guò)30個(gè)。4討論食品中的微生物有許多種類，有的可導(dǎo)致人類產(chǎn)生疾病，有的對(duì)人類無(wú)害，也有的可產(chǎn)生一些不能令人忽視的代謝產(chǎn)物，因此食品中的微生物，尤其是一些致病微生物常常是作為人類是否能夠食用該食品的重要指標(biāo)。而對(duì)于水及食品中大腸桿菌的快速測(cè)定也迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)所采用的方法與趙貴明等人所采用的方法一致，均為MPN法，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果一