微生物的獲得與利用GuangdongFoodandDrugVocationalCollege廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院張召副研究員ZhaoZhangassociateresearcher1、樣本采集及保存：通過低溫和樣本保存液保存樣品，延長(zhǎng)樣品保存時(shí)間和減少樣本中菌種損失。2、目標(biāo)菌種檢測(cè)：通過二代高通量深度測(cè)序技術(shù)/熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)等，檢測(cè)樣本中微生物的種類及其相對(duì)豐度，對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)控。3、目標(biāo)菌種分離：通過查閱文獻(xiàn)和資料和不同培養(yǎng)基分離得到的菌株，進(jìn)一步構(gòu)建目標(biāo)菌種的選擇培養(yǎng)基。微生物分離培養(yǎng)4、目標(biāo)菌種培養(yǎng)：利用選擇培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，對(duì)目的菌種進(jìn)行富集培養(yǎng)，同時(shí)利用96孔板進(jìn)行大規(guī)模的分離、純化等反復(fù)操作，找到目的菌株。5、目標(biāo)菌種鑒定：對(duì)最終純化好的目的菌株進(jìn)行16S、MALDI-TOFMS等快速鑒定技術(shù)確認(rèn)目標(biāo)菌株。微生物分離培養(yǎng)TidjaniAlou,M.etal.StateoftheArtintheCultureoftheHumanMicrobiota:NewInterestsandStrategies.ClinicalMicrobiologyReviews34,e00129-19(2020).微生物存活的關(guān)鍵運(yùn)用厭氧糞便收集裝置，在內(nèi)部創(chuàng)建厭氧氣體以保持原始微生物群組成和多樣性。樣本保存于含抗氧化劑的糞菌保護(hù)液中，減少暴露于氧氣環(huán)境的時(shí)間。減少糞便樣品冷藏運(yùn)輸和保存時(shí)間，盡快開展樣本分離培養(yǎng)。在冷凍保存或冷凍干燥糞菌液前，添加保護(hù)劑培養(yǎng)基（含蔗糖（10%）、海藻糖（10%）、脫脂乳（10%）和抗氧化劑）保持腸道細(xì)菌活力。

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通過流式細(xì)胞術(shù)和平板計(jì)數(shù)法評(píng)估糞便樣品保存和處理方式Bellali,S.,Lagier,J.-C.,Raoult,D.&BouKhalil,J.AmongLiveandDeadBacteria,theOptimizationofSampleCollectionandProcessingRemainsEssentialinRecoveringGutMicrobiotaComponents.FrontiersinMicrobiology10,(2019).智能集菌儀檢測(cè)樣品微生物存活技術(shù)微生物獲得來(lái)源與技術(shù)兼性厭氧菌，在厭氧條件下培養(yǎng)較有利于其生長(zhǎng)。菌落周圍無(wú)溶血環(huán)，不溶血，屬于γ-溶血瓊脂平板上圓形或似圓形、凸起、灰白色菌落；具有較好的胃腸液耐受性。

培養(yǎng)特性溶血反應(yīng)革蘭氏染色及鏡檢微生物的培養(yǎng)特性采用API50CH鑒定系統(tǒng)通過49個(gè)生化試驗(yàn)來(lái)對(duì)菌種的碳水化合物的代謝進(jìn)行檢定。LF0124hLF0148hLF01API試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表LF01API試驗(yàn)鑒定結(jié)果

LF01發(fā)酵半乳糖（GAL）、葡萄糖（GLU）、果糖（FRU）、甘露糖（MNE）、山梨糖（SBE）、甘露醇（MAN）、山梨醇（SOR）、乳糖（LAC）、蔗糖（SAC）、海藻糖（TRE）和松參糖（MLZ）等，且鑒定結(jié)果均為類干酪乳桿菌類干酪亞種，鑒定%均≥99.7%，T值均≥0.79。微生物生化特性菌株抗生素敏感性微生物的安全評(píng)價(jià)活菌藥物活菌藥物，又稱微生態(tài)活菌制品（Microecologicallivebacterialproducts）系由人體內(nèi)正常菌群成員或具有促進(jìn)正常菌群生長(zhǎng)和活性作用的無(wú)害外籍細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)、收集菌體、干燥成菌粉后，加入適宜輔料混合制成。用于預(yù)防和治療因菌群失調(diào)引起的相關(guān)癥狀和疾病?；罹幬锏亩x國(guó)內(nèi)，對(duì)于微生態(tài)藥物的管理并沒有明確的規(guī)定，早些年已經(jīng)有十幾種微生態(tài)制劑上市，其與現(xiàn)在FDA定義的活體生物藥有一定的區(qū)別；多為非處方藥物，適應(yīng)癥大多是籠統(tǒng)的急慢性腹瀉。當(dāng)時(shí)國(guó)內(nèi)臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)不太完善、審批政策也較為寬松。近10年無(wú)新品種上市。在美國(guó)，至今還沒有活菌藥物獲得批準(zhǔn)上市。目前在進(jìn)行特定活體生物藥物研發(fā)的公司有20多家，在研項(xiàng)目30多種，最快III期全球都在布局這一方向，無(wú)毒安全，免疫提升，潛力巨大010203全球現(xiàn)狀活菌藥物的定義工程菌，各國(guó)FDA均有

嚴(yán)格管控不會(huì)引起耐藥與依賴問題，攝入一定量的后，菌株定值治未病安全人來(lái)源，本身已適應(yīng)菌株來(lái)源與治療范圍廣環(huán)境、食材、各種動(dòng)物、食品、水源等，幾乎全部疾病都可以菌株定值后，產(chǎn)生大量的代謝物，和中藥作用類似活菌藥物的特點(diǎn)無(wú)依賴/無(wú)耐藥

截至2022年03月，國(guó)際上進(jìn)入臨床階段的LBP藥物有60個(gè)左右（圖1，2數(shù)據(jù)來(lái)源：企業(yè)官網(wǎng)、ClinicalTrial），其中進(jìn)入臨床III期的品種有6個(gè)。目前有更多針對(duì)新適應(yīng)癥（