1DB5101/TXXX—2021兔病毒性出血癥2型診斷技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了兔病毒性出血癥2型的臨床診斷、普通RT-PCR方法及熒光定量RT-PCR方法等診斷技本文件適用于成都市內(nèi)兔病毒性出血癥2型的鑒別與診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品的采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1兔病毒性出血癥2型rabbithemorrhagicdiseasetype2是由兔出血癥病毒2型引起的家兔和野兔的一種急性、高度傳染性、高致死率的疫病。4臨床診斷4.1流行特征各年齡段的家兔和野兔均易感，傳播快、死亡率高，死亡率為5%-70%，幼齡兔死亡率可高達100%。4.2臨床癥狀潛伏期1-3天。最急性的病例在發(fā)病后1-2h內(nèi)迅速死亡；急性發(fā)病兔表現(xiàn)為精神沉郁，食欲不振，體溫升高，呼吸困難，部分發(fā)病兔伴有神經(jīng)癥狀。4.3病理剖檢病死兔剖檢以肺臟出血、充血和脾臟腫大為主要特征，肝、腎等實質(zhì)器官可見出血等病變4.4臨床診斷結(jié)果判定結(jié)合流行病學特征，出現(xiàn)臨床癥狀和病理剖檢癥狀，可初步判定為疑似兔病毒性出血癥2型感染。2DB5101/TXXX—20215實驗室診斷樣品采集及處理實驗室診斷樣品樣品的采集及處理按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。病死兔按農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2017〕25號的規(guī)定執(zhí)行。6RT-PCR方法6.1試劑6.1.1RNA提取試劑6.1.2PCR預混液（2×);反轉(zhuǎn)錄試劑6.1.3無核酸酶水，配置方法見附錄A.16.1.4TAE緩沖液，配置方法見附錄A.26.1.51%的瓊脂糖凝膠，配置方法見附錄A.36.1.66×上樣緩沖液。6.2儀器設(shè)備6.2.1自動化核酸提取儀。6.2.2PCR擴增儀6.2.3臺式低溫高速離心機（最大離心力12000g以上）。6.2.4穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和水平電泳槽。6.2.5凝膠成像儀（或紫外投射儀）。6.2.6微量可調(diào)移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格）。6.2.7無核酸酶離心管與吸頭。6.2.8PCR擴增管。6.3引物序列引物針對RHDV2VP60基因的保守區(qū)域設(shè)計。上游引物RHDV2-F：5’-GTCATTTGTRCCCTTCAGCG-3’；下游引物RHDV2-R：5’-CATCAACACTCAAGCCAAGT-3’。擴增產(chǎn)物大小577bp。6.4操作步驟6.4.1RNA提取采用核酸提取試劑提取各類樣本中的病毒RNA?；蛴米詣踊怂崽崛x提取各類樣本中的病毒RNA。抽取的RNA立即進行后續(xù)試驗或置于-60℃以下保存。6.4.2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體系為10μL，在PCR反應(yīng)管中依次加入下列反應(yīng)物：5×AMV反應(yīng)緩沖液2μL；AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL；無核酸酶水4.0μL；3DB5101/TXXX—2021混勻后瞬時離心，隨后進入反轉(zhuǎn)錄循環(huán)37℃15min，65℃5s，產(chǎn)物直接用PCR擴增或暫存于-20℃?zhèn)溆谩?.4.3PCR擴增反應(yīng)體系每個樣品配置45μLPCR反應(yīng)混合液，組成如下：PCR預混液（2×)25μL將45μLPCR反應(yīng)混合液加入每個PCR擴增管；將5μL反轉(zhuǎn)錄模板加入PCR擴增管中。每次進行普通RT-PCR擴增時均需設(shè)立陽性對照（陽性重組質(zhì)粒為模板）、陰性對照（無核酸酶水為模板）。加入模板后，密封PCR管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在PCR儀中，按照6.4.4條件運行擴增程序。6.4.4擴增條件95℃預變性5min；94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃總延伸8min。6.4.5電泳用1×TAE緩沖液配置的1%瓊脂糖凝膠，取5μL-10μLPCR產(chǎn)物進行電泳20min～30min。電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像儀中成像判讀。6.5結(jié)果判定6.5.1陽性對照有大小約為577bp的特異性擴增條帶，且陰性對照樣品無擴增條帶，否則試驗結(jié)果視為無效。6.5.2被檢樣品有大小約為577bp的特異性擴增條帶，且與陽性對照條帶分子量大小相符，則該樣品判定兔出血癥病毒2型核酸陽性；被檢樣品無特異性的擴增條帶，則判定兔出血癥病毒2型核酸陰性。7熒光RT-PCR方法7.1試劑7.1.1RNA提取試劑7.1.2無核酸酶水，配置方法見A.17.1.3熒光PCR預混液（2×)7.2儀器設(shè)備7.2.1熒光PCR擴增儀7.2.2臺式低溫高速離心機（最大離心力12000g以上）。7.2.3微量可調(diào)移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同規(guī)格）。7.2.4無核酸酶離心管與吸頭。7.2.5PCR擴增管。4DB5101/TXXX—20217.3引物和探針引物和探針針對RHDV2VP60基因的保守序列設(shè)計。上游引物F:5’-GAGTGTTGATGGRTACTTC-3’，下游引物5’-R:CCCAAGTTGTACACAAGC-3‘；TaqMan探針：FAM-5’-AGCCACCCTCATYGACCTGT-3’BHQ1。7.4操作步驟7.4.1RNA提取與反轉(zhuǎn)錄方法同6.4.1和6.4.2。7.4.2擴增體系（20μL）每個樣品配置18μL熒光RT-PCR反應(yīng)混合液，組成如下：無核酸酶水5μL熒光PCR預混液（2×)10μLF（10μmol/L)1μLR（10μmol/L)1μLT（探針10μmol/L)1μL將18μL熒光PCR反應(yīng)混合液加入PCR擴增管；將2μLcDNA（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）加入每個PCR擴增管中。每次進行熒光RT-PCR擴增時均需設(shè)立陽性對照（陽性重組質(zhì)粒為模板）、陰性對照（無核酸酶水為模板）。加入模板后，密封PCR管，瞬時離心。將所有PCR擴增管放在PCR儀中，按照7.4.3條件運行擴增程序。7.4.3擴增條件95℃預變性3min；95℃變性10s，59℃退火10s，72℃延伸25s，45個循環(huán)，在每一循環(huán)的72℃延伸時搜集FAM熒光信號。7.5結(jié)果判定7.5.1陽性對照的Ct值≤30且出現(xiàn)特異性擴增曲線，陰性對照無Ct值或陰性對照Ct值≥40且無特異性擴增曲線，試驗結(jié)果有效；否則應(yīng)重新進行試驗。7.5.2被檢樣品Ct值≤36且出現(xiàn)特異性擴增曲線，則判定兔出血癥病毒2型核酸陽性；當無Ct值或Ct≥40,則判定兔出血癥病毒2型核酸陰性；當36<Ct值<40且出現(xiàn)特異性擴增曲線，則判定疑似。對疑似樣品應(yīng)重復檢測，結(jié)果仍為疑似，則判定兔出血癥病毒2型核酸陽性。5DB5101/TXXX—2021（規(guī)范性）反應(yīng)溶液的配置方法A.1無核酸酶水DEPC1mL去離子水1000mL充分混勻，將瓶蓋擰松后置于37℃放置過夜，高壓滅菌。A.250×TAE貯存液三羥甲基氨基甲烷（Tris）冰乙酸0.5mol/LEDTA（pH6.0）加蒸餾水至1000mL。242.0g57