谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)解決方案原理谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化還原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶之一。GSH-Px不僅能夠特異地催化還原型谷胱甘肽與活性氧（ROS）反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），從而保護(hù)生物膜免受ROS的損害，維持細(xì)胞的正常功能；而且具有保護(hù)肝臟、提高機(jī)體免疫力、拮抗有害金屬離子對(duì)機(jī)體的傷害和增加機(jī)體抗輻射等能力。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-Px的必需部分，測(cè)定GSH-Px的活力可以作為衡量機(jī)體硒水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)。CheKine?谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性檢測(cè)試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)生物樣本，如血清（漿）、動(dòng)物組織、細(xì)胞、細(xì)菌樣本中GSH-Px的活性。GSH-Px催化H2O2氧化GSH，產(chǎn)生GSSG；谷胱甘肽還原酶（GR）催化NADPH還原GSSG，再生GSH，同時(shí)NADPH氧化生成NADP+；NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定340nm光吸收減少速率來(lái)計(jì)算GSH-Px活性。自備耗材·酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)（能測(cè)340nm處的吸光度）·恒溫箱·96孔UV板或微量石英比色皿、可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·低溫離心機(jī)·去離子水·勻漿器（如果是組織樣本）試劑準(zhǔn)備AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。WorkingSubstrate：臨用前配制，Substrate加入20mLAssayBuffer，充分溶解；未用完的試劑分裝避光于-20℃保存1個(gè)月。GR：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。WorkingH2O2：臨用前配制，吸取21.5μLH2O2加入5mL去離子水，充分混勻，配制好的試劑當(dāng)天使用；4℃避光保存。WorkingReagent：臨用前配制，根據(jù)樣本數(shù)量，按照2mLWorkingSubstrate加入1μLGR的比例配制，再加6mL的AssayBuffer混勻（當(dāng)天用完）；WorkingRegent在25℃（其他物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中預(yù)熱30min以上。樣本制備注意：推薦使用新鮮樣本，如果不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本可在-80℃保存1個(gè)月。1.組織樣本：用冷的PBS清洗組織，盡可能去除血液。吸干組織上的水分，稱重。稱取0.1g組織樣本，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer，快速冰上勻漿。勻漿后的樣本，10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。2.血清（漿）：直接測(cè)定（如需要可用生理鹽水稀釋不同倍數(shù)）。3.細(xì)胞、細(xì)菌：收集500萬(wàn)細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，用冷PBS清洗細(xì)胞，離心后棄上清，加入1mL預(yù)冷的AssayBuffer，冰浴超聲波破碎細(xì)胞或細(xì)菌5min（功率20%或200W，超聲3s，間隔7s，重復(fù)30次），然后10,000g，4℃離心10min，取上清液，置冰上待測(cè)。注意：樣品處理等過(guò)程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力；細(xì)胞中GSH-Px活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在300萬(wàn)-500萬(wàn)之間，細(xì)胞中GSH-Px的提取時(shí)可加AssayBuffer后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。如需測(cè)定蛋白濃度，推薦使用Abbkine貨號(hào)：KTD3001的蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA法）進(jìn)行樣本蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟1.酶標(biāo)儀或紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，紫外分光光度計(jì)用去離子水調(diào)零。2.WorkingRegent于25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）孵育30min。3.在96孔UV板或微量石英比色皿中按照如下方式加樣：試劑空白孔（μL）測(cè)定孔（μL）去離子水200Sample020WorkingReagent160160WorkingH2O220204.充分混勻，空白孔在340nm處第10s和第10min10s的吸光值，分別記為A1，A2，測(cè)定孔在340nm處第10s和第10min10s的吸光值，分別記為A3，A4，計(jì)算ΔA空=A1-A2，ΔA測(cè)=A3-A4。注意：空白孔只需做1-2個(gè)即可。實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。測(cè)定反應(yīng)的溫度對(duì)測(cè)定結(jié)果有影響，請(qǐng)控制在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動(dòng)物）。如果ΔA測(cè)小于0.005可適當(dāng)加大樣本量。如果ΔA測(cè)大于1.0，樣本可用AssayBuffer進(jìn)一步稀釋，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)，或減少提取用樣本量。結(jié)果計(jì)算注意：我們?yōu)槟峁┑挠?jì)算公式，包括推導(dǎo)過(guò)程計(jì)算公式和簡(jiǎn)潔計(jì)算公式。兩者完全相等。建議以加粗的簡(jiǎn)潔計(jì)算公式為最終計(jì)算公式。使用96孔UV板測(cè)定的計(jì)算公式如下：1.按蛋白濃度計(jì)算GSH-Px活力單位定義：在25℃或37℃溫度下，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/mgprot)=[(ΔA測(cè)-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷(Cpr×V樣)÷T=321.6×(ΔA測(cè)-ΔA空)÷Cpr2.按樣本鮮重計(jì)算GSH-Px活力單位定義：在25℃或37℃溫度下，每克樣品每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/g鮮重)=[(ΔA測(cè)-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=321.6×(ΔA測(cè)-ΔA空)÷W3.按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算GSH-Px活力單位定義：在25℃或37℃溫度下，每104個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/104)=[(ΔA測(cè)-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=321.6×(ΔA測(cè)-ΔA空)÷5004.按液體體積計(jì)算活性單位定義：在25℃或37℃溫度下，每毫升液體每分鐘催化1nmolNADPH氧化。GSH-Px(U/mL)=[(ΔA測(cè)-ΔA空)÷(ε×d)×V反總×109]÷V樣÷T=321.6×(ΔA測(cè)-ΔA空)ΔA空=A1-A2，ΔA測(cè)=A3-A4；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=2×10-4L；109：1mol=1×109nmol；Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；W：樣品質(zhì)量，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=2×10-2mL；V樣總：提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；500：細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量，500萬(wàn)。使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式將上述計(jì)算公式中的光徑d:0.5cm調(diào)整為d:1cm進(jìn)行計(jì)算即可。相關(guān)產(chǎn)品CatalogNo.ProductNameKTB1600Che