酶切克隆連接本課程將深入探討酶切克隆連接技術(shù)的基本原理、操作步驟和應(yīng)用，幫助您掌握這一重要的分子生物學(xué)技術(shù)。課程簡(jiǎn)介課程目標(biāo)了解酶切克隆連接技術(shù)的基本原理和操作流程課程內(nèi)容涵蓋酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定等關(guān)鍵步驟酶切克隆的基本原理11.酶切利用限制性內(nèi)切核酶識(shí)別并切割特定DNA序列22.連接利用DNA連接酶將酶切后的DNA片段連接起來(lái)33.轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物導(dǎo)入受體細(xì)胞44.篩選篩選含有重組質(zhì)粒的克隆常用的限制性內(nèi)切核酶EcoRI識(shí)別序列：GAATTCHindIII識(shí)別序列：AAGCTTBamHI識(shí)別序列：GGATCCPstI識(shí)別序列：CTGCAG認(rèn)識(shí)限制性內(nèi)切核酶1識(shí)別特定DNA序列2切割DNA雙鏈3產(chǎn)生粘性末端或平末端酶切反應(yīng)的條件1溫度酶切反應(yīng)通常在37℃進(jìn)行2緩沖液提供最佳反應(yīng)環(huán)境3酶濃度根據(jù)酶的活性選擇合適的濃度4反應(yīng)時(shí)間通常在1-2小時(shí)內(nèi)完成常見限制性內(nèi)切核酶類型1I型切割位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)2II型切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)3III型切割位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)相鄰載體設(shè)計(jì)與選擇復(fù)制起點(diǎn)確保載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制多克隆位點(diǎn)提供多個(gè)酶切位點(diǎn)，方便插入目的基因選擇標(biāo)記基因便于篩選含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞啟動(dòng)子控制目的基因的表達(dá)質(zhì)粒載體概述環(huán)狀DNA分子自主復(fù)制攜帶外源基因方便篩選載體選擇注意事項(xiàng)1兼容性載體與宿主細(xì)胞的匹配性2大小載體大小應(yīng)適合宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化3穩(wěn)定性載體在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定性4表達(dá)效率載體對(duì)目的基因的表達(dá)效率常用載體類型介紹目的基因的獲取PCR擴(kuò)增利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因基因文庫(kù)篩選從基因文庫(kù)中篩選出目的基因基因合成人工合成目的基因PCR擴(kuò)增基因PCR儀提供循環(huán)升降溫條件試劑包括引物、模板、dNTP、Taq酶等限制性內(nèi)切核酶酶切1酶切反應(yīng)體系包含DNA、酶、緩沖液等2溫度控制根據(jù)酶的最佳反應(yīng)溫度進(jìn)行控制3時(shí)間控制確保酶切反應(yīng)完全DNA片段純化凝膠電泳分離不同大小的DNA片段膠回收回收目的DNA片段純化步驟利用試劑盒進(jìn)行DNA純化粘性末端連接1酶切產(chǎn)生粘性末端限制性內(nèi)切核酶切割DNA產(chǎn)生粘性末端2DNA連接酶催化連接DNA連接酶將粘性末端連接起來(lái)3形成重組質(zhì)粒載體和目的基因連接形成重組質(zhì)粒DNA連接酶的作用1催化磷酸二酯鍵形成2連接DNA片段3修復(fù)DNA斷裂粘性末端連接原理堿基互補(bǔ)配對(duì)氫鍵穩(wěn)定DNA連接酶催化磷酸二酯鍵形成反應(yīng)條件優(yōu)化1溫度連接反應(yīng)通常在4℃進(jìn)行2緩沖液提供最佳反應(yīng)環(huán)境3連接酶濃度根據(jù)連接酶的活性選擇合適的濃度4時(shí)間控制通常在12-16小時(shí)內(nèi)完成轉(zhuǎn)化與篩選感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備制備具有轉(zhuǎn)化能力的細(xì)菌轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞篩選篩選含有重組質(zhì)粒的細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞準(zhǔn)備1CaCl2處理增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性2低溫處理使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)3熱休克促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞熱休克轉(zhuǎn)化法細(xì)菌培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)化反應(yīng)將感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物混合熱休克處理在冰水浴和熱休克之間進(jìn)行切換陽(yáng)性克隆篩選選擇性培養(yǎng)基抗生素篩選藍(lán)白斑篩選PCR鑒定重組子鑒定酶切鑒定利用限制性內(nèi)切核酶進(jìn)行鑒定測(cè)序鑒定對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證表達(dá)鑒定檢測(cè)目的基因是否表達(dá)酶切鑒定1酶切重組質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切核酶切割重組質(zhì)粒2凝膠電泳分析觀察酶切片段的大小，判斷是否含有目的基因測(cè)序鑒定測(cè)序反應(yīng)進(jìn)行DNA測(cè)序反應(yīng)測(cè)序結(jié)果分析分析測(cè)序結(jié)果，驗(yàn)證目的基因是否插入表達(dá)鑒定1Westernblot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況2RT-PCR檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄水平3功能驗(yàn)證驗(yàn)證目的基因的功能實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)滅菌操作嚴(yán)格進(jìn)行滅菌操作，防止污染低溫保存酶、DNA等試劑需低溫保存實(shí)驗(yàn)記錄詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果滅菌操作低溫保存1酶類2-20℃或-80℃3DNA4-20℃5細(xì)菌6-80℃實(shí)驗(yàn)記錄實(shí)驗(yàn)日期實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)分析典型案例分享1構(gòu)建綠色熒光蛋白表達(dá)載體以綠色熒光蛋白為目的基因，構(gòu)建表達(dá)載體2轉(zhuǎn)化大腸桿菌將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌3篩選陽(yáng)性克隆篩選含有重組質(zhì)粒的克隆4表達(dá)鑒定觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)解析1載體選擇選擇合適的表達(dá)載體2酶切位點(diǎn)選擇合適的限制性內(nèi)切核酶3轉(zhuǎn)化方法選擇合適的轉(zhuǎn)化方法4篩選方法選擇合適的篩選方法關(guān)鍵步驟講解酶切利用限制性內(nèi)切核酶切割DNA片段連接利用DNA連接酶連接DNA片段轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論1酶切鑒定結(jié)果分析酶切片段的大小2測(cè)序鑒定結(jié)果驗(yàn)證目的基因是否插入3表達(dá)鑒定結(jié)果觀察目的基因的表達(dá)情況總結(jié)與展望酶切克隆技術(shù)發(fā)展歷程從傳統(tǒng)方法到現(xiàn)代技術(shù)技術(shù)應(yīng)用前景廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域未來(lái)展望更快速、更高效、更精準(zhǔn)的克隆技術(shù)酶切克隆技術(shù)發(fā)展歷程11970s限制性內(nèi)切核酶的發(fā)現(xiàn)21980sPCR技術(shù)的出現(xiàn)31990s基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用