分子生物學(xué)檢驗技術(shù)基因測序技術(shù)生物化學(xué)檢驗教研室學(xué)習(xí)目標掌握：DNA測序技術(shù)的基本原理、主要步驟熟悉：第一代DNA測序技術(shù)的體系組成了解：自動化測序的方法目錄雙脫氧鏈末端終止法01化學(xué)降解法02自動化測序03CONTENTS分子生物學(xué)檢驗技術(shù)CONTENTS自動化測序PART03自動化測序新一代測序技術(shù)/NGS/高通量測序/二代測序：特點：高通量快速基因組測序、轉(zhuǎn)錄譜分析、ChIP測序等大規(guī)模DNA測序分析。自動化測序測序平臺測序原理開發(fā)公司454焦磷酸合成測序RocheSolexa、Hiseq邊合成邊測序IlluminaSOLiD連接DNA測序ABI自動化測序自動化測序自動化測序Illumia測序利用可逆終止的熒光dNTP，邊合成邊測序。原理將基因組DNA的隨機片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flowcell流動池），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在Flowcell上形成了數(shù)以億計Cluster，每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。芯片處理Flowcell，流動池8條通道；內(nèi)表面做了化學(xué)修飾：兩種DNA引物種到玻璃表面（共價鍵連接）。兩種DNA引物與DNA文庫的接頭序列互相配對。DNA文庫DNA片段兩端接上人工接頭基因組，打斷，成為片段核苷酸序列不同，未知接頭可以和引物堿基互補配對。DNA文庫橋式PCR將文庫加入到芯片上，進行擴增的過程。通過文庫兩端的人工接頭和芯片上的2種引物互補，從而連接。dNTP和聚合酶作用下，開始延長。形成新的互補DNA鏈。橋式PCR加入NaOH，后解開雙鏈，其中沒有共價結(jié)合于芯片上的那條鏈被沖走。加入中性液體，稀釋堿液后，DNA鏈另一端引物與芯片的另一引物配對，形成橋。橋式PCR加入聚合酶和dNTP，在橋上重新合成新鏈。加入堿，將兩條鏈解開。再加入中和液，鏈再與芯片引物雜交。如此反復(fù)指數(shù)增長測序加入可逆終止的熒光dNTP：鏈接臂熒光基團疊氮基團：阻止聚合，巰基試劑可使疊氮基斷裂，恢復(fù)3’羥基。測序邊合成邊測序加入測序引物，可逆dNTP，DNA聚合酶。每次只延長一個堿基。在激光下確定顏色，即哪個堿基。用試劑去掉熒光和疊氮基團。繼續(xù)延長下一個堿基。Illumia1Illumia2Illumia3測序第三代測序技術(shù)01它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序速度是化學(xué)法測序的2萬倍。它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。02它的精度非常高，達到99.9999%。0304可直接測RNA序列。05可直接測甲基化的DNA序列。自動化測序DNA測序技術(shù)經(jīng)過30多年的發(fā)展，目前已經(jīng)到了第三代，三代測序技術(shù)有各自的優(yōu)勢。第一代測序技術(shù)雖然成本高，速度慢，但是對于少量的序列來說，仍是最好的選擇，所以在以后的一段時間內(nèi)仍將存在；第二代測序技術(shù)剛剛商用不久，正在逐漸走向成熟；第三代測序技術(shù)有的剛