ICS71.100.70CCSY42團體標(biāo)準(zhǔn)T/ZHCA031—2024淋洗類化妝品溫和性評價重建表皮模型組織活力法Evaluationformildnessofrinse-offcosmeticproducts—Tissueviabilitymethodofreconstructedepidermalmodel2024-01-15發(fā)布2024-04-15實施浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會ⅠT/ZHCA031—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由浙江省食品藥品檢驗研究院提出。本文件由浙江省健康產(chǎn)品化妝品行業(yè)協(xié)會(ZHCA)歸口。本文件起草單位:浙江省食品藥品檢驗研究院、廣東博溪生物科技有限公司、珀萊雅化妝品股份有限公司、上海家化聯(lián)合股份有限公司、愛茉莉太平洋(上海)研發(fā)有限公司。1T/ZHCA031—2024淋洗類化妝品溫和性評價重建表皮模型組織活力法1范圍本文件描述了采用重建表皮模型對淋洗類化妝品溫和性功效的評價方法。本文件適用于淋洗類化妝品溫和性功效的評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件淋洗類化妝品rinse-offcosmeticproduct在人體表面(皮膚、毛發(fā)、甲、口唇等)使用后及時清洗的化妝品。3.2溫和性mildness經(jīng)過安全評估的受試物在正常、合理及可預(yù)見的使用條件下,未引起皮膚異常反應(yīng)的特性。3.3重建表皮模型reconstructedepidermalmodel分離人組織表皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞,經(jīng)過體外培養(yǎng),制備成與人表皮組織具有相似結(jié)構(gòu)及功能的三維組織模型。4試驗原理將經(jīng)安全性評價為無刺激性的受試樣品均勻涂抹在重建表皮模型上,經(jīng)過比刺激性測試更長的暴露時間或更高暴露量后,根據(jù)模型細(xì)胞的存活率,評價受試樣品的溫和性。5試劑和材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的三級水。5.1聚乙二醇單-4-辛基苯基醚(TritonX-100)。5.2十二烷基硫酸鈉(SDS)。2T/ZHCA031—20245.3異丙醇。5.4噻唑藍(lán)(MTT)。5.5磷酸鹽緩沖液(DPBS):pH7.0~7.3,不含鈣、鎂離子。5.61.0%TritonX-100溶液:吸取TritonTMX-100(5.1)10μL,溶于990μL水中,配制成體積分?jǐn)?shù)為1.0%的TritonX-100溶液。5.70.1%SDS溶液:稱取SDS(5.2)10mg,溶于10mL水中,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS溶液。5.8MTT溶液:稱取噻唑藍(lán)(5.4)20mg,溶于20.0mLDPBS(5.5)中,配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的MTT溶液,臨用現(xiàn)配。5.9重建表皮模型試劑盒:EpiKutisRHE模型及其培養(yǎng)液、SkinEthicRHE模型及其培養(yǎng)液或其他經(jīng)驗證的等效模型及其培養(yǎng)液。接收時模型與培養(yǎng)基接觸界面不應(yīng)有明顯氣泡或固體培養(yǎng)基變色情況(如黑紫色)。5.10死亡組織模型:將重建表皮模型置于-20℃環(huán)境下冷凍24h以上。5.111.0%樣品液:取受試物100μL,溶于9900μL水中,配制成體積分?jǐn)?shù)為1.0%的樣品液。5.127.5%樣品液:取受試物75μL,溶于925μL水中,配制成體積分?jǐn)?shù)為7.5%的樣品液。5.13尼龍膜:與SkinEthicRHE模型內(nèi)徑相同的尼龍膜。6儀器設(shè)備6.1天平:分度值為0.0001g。6.2二氧化碳培養(yǎng)箱:37℃±1℃、CO2的體積分?jǐn)?shù)范圍為(5±1)%、相對濕度≥95%。6.3超凈工作臺或生物安全柜。6.4外置活塞式移液器:最大量程為50μL、100μL、200μL。6.5連續(xù)分液器:25mL。6.6計時器。6.7微孔板振蕩器。6.8酶標(biāo)儀:配570nm波長濾光片。7測試方法7.1MTT干擾因素排查7.1.1當(dāng)受試樣品與MTT有反應(yīng)時:取MTT溶液1.0mL,加入受試樣品液80μL(方法一使用1.0%樣品液,方法二使用7.5%樣品液),分別在0h、1h、2h和3h時觀察樣品周邊溶液顏色變化情況。當(dāng)溶液顏色變成藍(lán)紫色,應(yīng)增加死亡組織模型組。7.1.2當(dāng)受試樣品有顏色時:取受試樣品液80μL(方法一使用1.0%樣品液,方法二使用7.5%樣品液),加入2mL異丙醇中,受試樣品不溶于異丙醇,無須增加死亡組織模型對照組;受試樣品溶于異丙醇,在570nm波長處測定吸光度(OD570),若OD570≥0.15,應(yīng)增加死亡組織模型組。7.2測試步驟:方法一(EpiKutisRHE)7.2.1重建表皮模型復(fù)蘇在超凈工作臺或生物安全柜中將合格的模型轉(zhuǎn)移至含0.9mL培養(yǎng)液的無菌6孔培養(yǎng)板,放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h。更換全部培養(yǎng)液,放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。模型底部與培養(yǎng)液間不應(yīng)出3T/ZHCA031—2024現(xiàn)氣泡。7.2.2試驗分組和加樣試驗分為陰性對照組(水)、陽性對照組(1.0%TritonX-100溶液或0.1%SDS溶液)和受試樣品(1.0%樣品液)組,當(dāng)出現(xiàn)7.1中的情況時,增加死亡組織模型陰性對照組和死亡組織模型受試樣品組,每組平行使用3個模型。加樣前更換全部培養(yǎng)液,采用外置活塞式移液器吸取1.0%樣品液80μL均勻涂抹在模型表面,放入二氧化碳培養(yǎng)箱暴露24h。7.2.3沖洗暴露結(jié)束后,采用連續(xù)分液器吸取25mLDPBS將模型逐個進(jìn)行沖洗,每次2mL,未沖洗干凈應(yīng)增加沖洗次數(shù)直至沖洗干凈,吸干殘余的DPBS。7.2.4甲瓚提取將模型轉(zhuǎn)移至含300μLMTT溶液的24孔培養(yǎng)板中,模型底部與MTT溶液間不應(yīng)出現(xiàn)氣泡。放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h后,轉(zhuǎn)移至新的24孔培養(yǎng)板中,每孔加入2mL異丙醇,用封口膜密封培養(yǎng)板間隙。室溫條件下將培養(yǎng)板固定在微孔板振蕩器上振搖2h提取甲瓚,或在4℃條件下提取過夜。7.2.5OD570的測定提取結(jié)束后,用移液器吸頭戳破模型,將模型內(nèi)外提取液混合均勻,并轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中,每個組織模型取2個復(fù)孔,200μL/孔。用異丙醇作為溶劑對照,取6個復(fù)孔,在570nm波長處讀取吸光度(OD570),計算組織的存活率。7.2.6數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析無死亡組織模型對照組的存活率按式(1)計算。存活率×100%…………(1)式中:A—受試樣品的OD570;B—溶劑對照(異丙醇)的OD570平均值;C—陰性對照的OD570。有死亡組織模型對照組的存活率按式(2)計算。存活率×100%…………式中:A—受試樣品的OD570;B—溶劑對照(異丙醇)的OD570平均值;C—陰性對照的OD570;D—受試樣品死亡組織的OD570;E—陰性對照死亡組織的OD570。4T/ZHCA031—20247.3測試步驟:方法二(SkinEthicRHE)7.3.1重建表皮模型復(fù)蘇在超凈工作臺或生物安全柜中將合格的模型轉(zhuǎn)移至含1.0mL培養(yǎng)液的無菌12孔培養(yǎng)板,放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h。更換全部培養(yǎng)液,放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。模型底部與培養(yǎng)液間不應(yīng)出現(xiàn)氣泡。7.3.2試驗分組和加樣試驗分為陰性對照組(不添加)、陽性對照組(1.0%TritonX-100溶液或0.1%SDS溶液)和受試樣品(7.5%樣品液)組,當(dāng)出現(xiàn)7.1中的情況時,增加死亡組織模型陰性對照組和死亡組織模型受試樣品組,每組平行使用2個模型。加樣前更換全部培養(yǎng)液,采用外置活塞式移液器吸取7.5%樣品液30μL均勻涂抹在模型表面,蓋上尼龍膜,放入二氧化碳培養(yǎng)箱暴露18h。7.3.3沖洗暴露結(jié)束后,采用連續(xù)分液器吸取25mLDPBS將模型逐個進(jìn)行沖洗,每次2mL,未沖洗干凈應(yīng)增加沖洗次數(shù)直至沖洗干凈,吸干殘余的DPBS。7.3.4甲瓚提取將模型轉(zhuǎn)移至含300μLMTT溶液的24孔培養(yǎng)板中,模型底部與MTT溶液間不應(yīng)出現(xiàn)氣泡。放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h后,轉(zhuǎn)移至新的24孔培養(yǎng)板中,每孔模型內(nèi)外各加入750μL異丙醇,用封口膜密封培養(yǎng)板間隙。室溫條件下將培養(yǎng)板固定在微孔板振蕩器上振搖2h提取甲瓚,或在4℃條件下提取過夜。7.3.5OD570的測定提取結(jié)束后,用移液器吸頭戳破模型,將模型內(nèi)外提取液混合均勻,并轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中,每個組織模型取2個復(fù)孔,200μL/孔。用異丙醇作為溶劑對照,取6個復(fù)孔,在570nm波長處讀取吸光度OD570,計算組織的存活率。7.3.6數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析8結(jié)果判定8.1試驗成立條件8.1.1陰性對照組的OD570范圍為1.0~2.5。8.1.2陽性對照組的存活率<15%。8.1.3同一樣品復(fù)孔間SD<18%。8.2結(jié)果評價8.2.1溫和性:存活率≥50%。5T/ZHCA031—20248.2.2不判定:存活率<50%,需結(jié)合其他試驗進(jìn)一步確認(rèn)。9試驗報告試驗報告至少應(yīng)給出以下幾個方面的內(nèi)容:a)檢驗依據(jù);b)樣品和陽性對照組的信息,包括與試驗操作相關(guān)的理化性狀;c)重建表皮模型來源、質(zhì)檢報告等相關(guān)信息;d)試驗條件和方法,包括試驗具體步驟;e)數(shù)據(jù)處理與結(jié)果評價方法;f)試驗的日期;g)