—牛角膜渾濁度和滲透性試驗BovineCornealOpacityandPermeability(BCOP)Assay1范圍本方法規(guī)定了牛角膜渾濁度和滲透性試驗的基本原則、要求和方法。本方法適用于化妝品原料的潛在不可逆眼損傷和無刺激性的評價，適用于單一物質(zhì)及混合物。2試驗?zāi)康谋驹囼炌ㄟ^定量測定牛角膜渾濁度和滲透性的變化，以評價化學(xué)品原料對眼角膜的不可逆眼損傷程度。3定義3.1眼睛刺激性EyeIrritation眼球表面接觸受試物后所產(chǎn)生的可逆性炎性變化。3.2不可逆眼損傷IrreversibleEyeDamage眼球表面接觸受試物后引起的不可逆性組織損傷。3.3角膜的渾濁度CornealOpacity角膜暴露于受試物后通透性改變的程度，角膜渾濁度增加表明角膜受損。3.4角膜的滲透性CornealPermeability測定通過角膜細(xì)胞層的熒光素鈉染料的量來代表角膜上皮損傷的指標(biāo)。4試驗原理牛角膜渾濁度和滲透性試驗是牛角膜接觸化妝品原料后，通過測定角膜渾濁度和滲透性的變化來評估化學(xué)品原料的眼刺激程度。5試劑和材料5.1培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液MEM培養(yǎng)液（含酚紅）5.2Hanks’溶液稱取氯化鈣140mg、六水合氯化鎂100mg、七水合硫酸鎂100mg、氯化鉀400mg、磷酸二氫鉀60mg、碳酸氫鈉350mg、氯化鈉8g、磷酸氫二鈉48mg、葡萄糖1g，加水至1L。臨用新配。5.3熒光素鈉溶液液體受試物和固體受試物分別選用濃度為4mg/mL和5mg/mL的熒光素鈉溶液進行滲透性試驗。5.4陽性對照N，N-二甲基甲酰胺作為液體受試物的陽性對照，20%咪唑溶液作為固體受試物的陽性對照。5.5陰性對照物0.9%氯化鈉溶液5.6牛眼大于6月齡的牛眼，直徑為1.8cm~2.5cm。牛眼放在2℃~4℃的Hanks’溶液中的使用時間為24h內(nèi)。5.7渾濁度儀及角膜夾持器（見附錄A）渾濁度儀是用來測量渾濁度的裝置。根據(jù)渾濁度儀的光源不同，分為白光光源的渾濁度儀和單色光源的渾濁度儀。不同光源，體外刺激分的計算公式不同。角膜夾持器由前室和后室兩部分組成，前后室的內(nèi)部直徑均為1.7cm，深度2.2cm。6試驗步驟6.1牛角膜的制備剔除渾濁、有劃痕、白斑、新生血管形成的牛眼。取無缺陷的牛眼，沿鞏膜邊緣2mm~3mm剪取并剝離角膜，角膜內(nèi)皮層向上，置于Hanks’溶液中。6.2角膜安裝角膜內(nèi)皮層向下對準(zhǔn)O型環(huán)放置在夾持器的后室上，再將前室蓋在角膜上，前后室組合，旋緊。6.3角膜平衡按先后室再前室的順序，將32℃預(yù)熱的MEM培養(yǎng)液加滿夾持器的前后室，確保沒有氣泡，將固定好的角膜夾持器垂直放置于32±1℃恒溫設(shè)備中平衡1h。6.4基準(zhǔn)渾濁度的測定角膜平衡后，按先前室再后室的順序，吸出前后室培養(yǎng)液，重新加入預(yù)熱的MEM培養(yǎng)液。渾濁度儀測定并記錄每個角膜的渾濁度值，作為基準(zhǔn)渾濁度。白光光度儀測定渾濁度小于7的角膜、單色光渾濁度儀測定值介于1200lux到1850lux之間的角膜為合格角膜。6.5角膜的分組取基準(zhǔn)渾濁度符合要求的牛角膜，每次試驗設(shè)受試物組、陽性對照組和陰性對照組，每組至少3只角膜。6.6受試物暴露受試物暴露方式有兩種，一種針對液體和表面活性劑（固體或液體），另一種針對非表面活性劑固體。液體和表面活性劑以原液給樣；半固體、乳霜和蠟通常按液體測試；純表面活性劑以配制成濃度為10%液體測試。暴露時間為10min。非表面活性劑固體以配制成濃度為20%溶液或混懸液給樣，暴露時間為4h。溶劑首選0.9%氯化鈉溶液，也可根據(jù)受試物的性質(zhì)選擇蒸餾水或其他可證明對測試系統(tǒng)無影響的溶劑。受試物根據(jù)物化性質(zhì)給樣方式有兩種，一種直接給樣法用于非粘性到微粘性的液體化學(xué)品，另一種開窗法適用于半粘性和粘性液體化學(xué)品以及純固體。確保測試化學(xué)品充分覆蓋上皮表面，并在沖洗步驟中充分去除。直接給樣：取分組后帶有角膜的夾持器，吸去前室液體，加入750μL受試物于前室中，全部加樣后，確保樣品覆蓋整個角膜，角膜內(nèi)皮層朝下水平放置于32±1℃恒溫設(shè)備中。開窗給樣：用開窗器移除前室的玻璃片，夾持器前室在上，水平放置。用棉球輕輕吸干角膜上殘存培養(yǎng)液，取750μL受試物均勻平鋪在角膜上，置于32±1℃恒溫設(shè)備，暴露時間為10min。6.7暴露后渾濁度值測定暴露結(jié)束后，吸出前室內(nèi)的受試物，用MEM(含酚紅)培養(yǎng)液將角膜沖洗三次，再用MEM培養(yǎng)液沖洗至無色，再將MEM培養(yǎng)液加入前室，渾濁度儀測定每個角膜的渾濁度。液體受試物測定后，角膜夾持器需垂直置于32±1oC的恒溫設(shè)備中再孵育2h，再次更換前后室培養(yǎng)液，測定每個角膜的渾濁度，作為終渾濁度。對于固體受試物，暴露結(jié)束沖洗后測定的渾濁度值直接作為終渾濁度，無需后孵育。每只角膜的渾濁度改變值為終渾濁度減去基準(zhǔn)渾濁度。計算每組中角膜渾濁度改變值的平均值作為平均渾濁度。渾濁度改變值=終渾濁度-基準(zhǔn)渾濁度6.8光密度值測定吸去前室培養(yǎng)液，加入1mL熒光素鈉溶液，夾持器前室向上水平放置32±1oC恒溫設(shè)備中孵育90min。取后室液體360μL用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定光密度值，計算每組角膜的光密度值的平均值作為平均光密度值。當(dāng)光密度值超出線性范圍時，對測定液進行稀釋光密度值=稀釋倍數(shù)×（稀釋后測定液的光密度值-陰性對照光密度值）6.9體外刺激分?jǐn)?shù)計算根據(jù)渾濁度儀的光源不同，分別選用下列不同的體外刺激分?jǐn)?shù)計算公式：白光渾濁度儀體外眼刺激得分（IVIS）=平均渾濁度+15×平均光密度值單色光渾濁度儀體外眼刺激分?jǐn)?shù)（LIS）=平均渾濁度（單色光源光度值lux/7）+15×平均光密度值7試驗成立條件陰性對照體外刺激分類屬于無刺激性，液體受試物陽性對照N，N-二甲基甲酰胺或固體受試物的陽性對照咪唑眼刺激等級分類為I類不可逆眼損傷，則此次試驗成立。8結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)表1眼刺激性反應(yīng)分級體外刺激分眼刺激分類白光光源單色光源IVIS≤3LIS≤30無刺激性3<IVIS≤55LIS>30且lux/7≤145且OD490≤2.5不可單獨預(yù)測*IVIS>55LIS>30且lux/7≤145且OD490>2.5或者LIS>30且lux/7>145不可逆眼損傷，I類*該分類需結(jié)合其他方法進一步判定。9結(jié)果解釋當(dāng)出現(xiàn)以下情況時，認(rèn)為檢測結(jié)果不確定：（1）3個角膜中的2個與平均值的結(jié)果不一致，或（2）3個角膜中的1個與平均值結(jié)果不一致，并且白光光源渾濁度儀：得到的IVIS分?jǐn)?shù)>比55臨界值大10；單色光源渾濁度儀：渾濁度分為不可逆眼損傷I類（平均Lux/7>145），但3只角膜中的1只Lux/7<130；單色光源渾濁度儀：光密度值分為不可逆眼損傷I類（平均光密度值>2.5），但3只角膜中的1只光密度值<2.0；單色光源渾濁度儀：LIS分?jǐn)?shù)為無刺激性（平均LIS分?jǐn)?shù)≤30），但3只角膜中的1只LIS分?jǐn)?shù)>40；當(dāng)檢測結(jié)果不確定時，應(yīng)重復(fù)測試，當(dāng)?shù)谝淮螜z測結(jié)果與第二次檢測結(jié)果相反時，應(yīng)進行第三次檢測，以第三次檢測結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)。本試驗結(jié)果能預(yù)測受試物的不可逆眼損傷和無刺激性，可作為不可逆眼損傷和刺激性的確定性方法中的組合方法之一。附錄渾濁度儀和夾持器渾濁度儀渾濁度儀是牛角膜渾濁度和滲透性試驗中用來測量透光率的裝置。根據(jù)渾濁度儀的光源不同，分為白光光源的渾濁度儀和單色光源的渾濁度儀。根據(jù)光源的不同，目前市面上渾濁度儀主要有采用鹵素?zé)舻腛P-KIT渾濁度儀，采用氦氖綠光激光器的LLBO渾濁度儀以及LED白光光源和LED綠色光源的渾濁度儀。任何類型的渾濁度儀都應(yīng)符合為一系列渾濁度讀數(shù)提供線性響應(yīng)，包含預(yù)測模型所涉及的不同刺激等級的閾值。其他證明與經(jīng)過驗證儀器具有相似的結(jié)果的設(shè)備也可以在實驗室使用。角膜夾持器BCOP角膜夾持器由惰性材料（如聚丙烯）制成。夾持器由兩（前室和后室）兩部分組成，前后室由三個不銹鋼螺釘固定，位于前后室的外邊緣。前后室均有1個圓柱形內(nèi)腔。每個腔室容積約5mL。兩端各有一個玻璃片。渾濁度儀透過玻璃片檢測光通過內(nèi)徑的渾濁度。在開窗暴露時，應(yīng)將前室端的玻璃片用開窗器移除。玻璃窗和腔室間以及后室的O型環(huán)用于防止液體泄漏。前后室頂部的兩個孔用于加入和移除受試物和培養(yǎng)基。在暴