—牛角膜渾濁和滲透性試驗(yàn)方法起草說(shuō)明為加強(qiáng)化妝品的監(jiān)督管理，進(jìn)一步提高化妝品使用安全性，中國(guó)食品藥品檢定研究院組織開(kāi)展了牛角膜渾濁和滲透性試驗(yàn)方法的研究制定工作。現(xiàn)就工作有關(guān)情況說(shuō)明如下：起草原則本方法主要參照OECD2020年發(fā)布的“化學(xué)品測(cè)試指南——牛角膜渾濁和滲透性測(cè)試方法”（TG437）進(jìn)行編制。本標(biāo)準(zhǔn)制定在充分考慮動(dòng)物福利的前提下，本著科學(xué)性、合理性、規(guī)范性、易操作的原則，經(jīng)過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外測(cè)定牛角膜通透性的牛角膜濁度儀器數(shù)據(jù)比較、建立了牛角膜通透性滲透性試驗(yàn)方法并優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件、對(duì)試驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證、與我國(guó)現(xiàn)行的體內(nèi)動(dòng)物數(shù)據(jù)比較、征求專家意見(jiàn)、修改完善標(biāo)準(zhǔn)草案稿等過(guò)程，明確不同受試物劑型的給樣方式和處理方法，以及對(duì)不同儀器得到的參數(shù)的計(jì)算公式進(jìn)行具體化和明確化，突出體現(xiàn)方法適用性與可操作性。起草過(guò)程本研究于2023年11月由化妝品標(biāo)準(zhǔn)專家委員會(huì)立項(xiàng)，項(xiàng)目組于2024年8月19日召開(kāi)項(xiàng)目研討會(huì)，總結(jié)課題進(jìn)展情況及下一階段工作安排各參編單位對(duì)本標(biāo)準(zhǔn)的重點(diǎn)、難點(diǎn)和關(guān)鍵問(wèn)題進(jìn)行了充分的討論，介紹課題進(jìn)展情況及下一步工作。項(xiàng)目組在研究和分析國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，起草了本標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說(shuō)明，形成方法草案。2024年9月本標(biāo)準(zhǔn)草案通過(guò)結(jié)題專家論證，形成如下意見(jiàn)及結(jié)論：將國(guó)內(nèi)外使用的渾濁度儀都列入標(biāo)準(zhǔn)中，體現(xiàn)國(guó)產(chǎn)濁度儀的先進(jìn)性。按照要求修改方法起草說(shuō)明，規(guī)范方法文本，修改后再審。修改后對(duì)外征求意見(jiàn)，根據(jù)反饋情況對(duì)文本進(jìn)行修改。與我國(guó)已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系我國(guó)現(xiàn)已發(fā)布的眼刺激評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)主要有《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章4化妝品急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)、《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》第六章21化妝品用化學(xué)原料體外兔角膜上皮細(xì)胞短時(shí)暴露試驗(yàn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21609-2008《化學(xué)品急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)方法》、GB/T15670.8-2017《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法第8部分：急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)》和GB/T16886.10-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第10部分《刺激與遲發(fā)性超敏反應(yīng)試驗(yàn)》。本方法在參考上述我國(guó)已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，主要針對(duì)化妝品原料的特點(diǎn)，以現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中《化妝品用化學(xué)原料體外兔角膜上皮細(xì)胞短時(shí)暴露試驗(yàn)》的寫(xiě)作框架為模板，針對(duì)眼刺激的不同刺激等級(jí)進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)，本著對(duì)不同類型化妝品原料檢測(cè)適用性及可操作性的原則進(jìn)行編制。與《規(guī)范》中原方法的對(duì)比情況表1與規(guī)范中原方法對(duì)比情況1.標(biāo)準(zhǔn)名稱化妝品急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)化妝品用化學(xué)原料體外兔角膜上皮細(xì)胞短時(shí)暴露試驗(yàn)牛角膜通透性滲透性試驗(yàn)方法2.判定標(biāo)準(zhǔn)不可逆眼損傷可逆眼損傷2A2B不分類//無(wú)刺激和微刺激GHS分類I不可預(yù)測(cè)不分類3.試驗(yàn)系統(tǒng)家兔SIRC細(xì)胞牛角膜4.關(guān)鍵儀器和設(shè)施動(dòng)物房，裂隙燈細(xì)胞房，酶標(biāo)儀渾濁度儀酶標(biāo)儀5.適用范圍化妝品和化妝品用化學(xué)原料化妝品用化學(xué)原料化妝品用化學(xué)原料及配方6.試驗(yàn)周期14-21天2-3天1天國(guó)際相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)情況本方法以O(shè)ECDTG437

2020年發(fā)布“化學(xué)品檢測(cè)指南——牛角膜通透性和滲透性測(cè)試方法”（OECD

Guidelines

for

Testing

of

Chemicals:

BovinecornealopacityandpermeabilityTestMethod）為依據(jù)進(jìn)行撰寫(xiě)，結(jié)合國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)條件、儀器設(shè)備現(xiàn)狀及操作的具體情況，撰寫(xiě)的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容?；竞w了實(shí)驗(yàn)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果計(jì)算、結(jié)果判定以及試驗(yàn)成立條件的技術(shù)要求，重點(diǎn)突出了通透性和滲透性測(cè)定以及體外刺激分?jǐn)?shù)的計(jì)算和確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證情況起草單位實(shí)驗(yàn)室首先收集了OECD推薦的12種參比化合物，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部驗(yàn)證,檢測(cè)結(jié)果與體內(nèi)數(shù)據(jù)分類一致。2023年12月邀請(qǐng)了三家外部實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證，3家機(jī)構(gòu)對(duì)于提供的12種參比化合物（7種為陽(yáng)性，5種為陰性）的檢測(cè)結(jié)果，除氯已定和氰酸鉀刺激分類等級(jí)不一致外，其余10種參比物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果均一致?？傮w準(zhǔn)確率、特異性、靈敏性均大于85%，滿足實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證的要求。同時(shí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部對(duì)目前國(guó)內(nèi)外兩大類白光光源濁度儀（鹵素光源和LED光源）和單色光源濁度儀（激光光源和LED綠光光源）4種儀器檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)，13種參比化合物中，除單色光源濁度儀對(duì)氯己定刺激等級(jí)錯(cuò)誤分類，其余檢測(cè)結(jié)果均一致。適用于預(yù)測(cè)化妝品用化學(xué)原料的潛在眼刺激性，測(cè)試結(jié)果的總體準(zhǔn)確率、特異性、靈敏性良好，可有效替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。其他需說(shuō)明的問(wèn)題。1.陽(yáng)性化合物的選擇試驗(yàn)中陽(yáng)性化合物選擇20%咪唑作為參考固體受試物陽(yáng)性物質(zhì)，N，N-二甲基甲酰胺作為參考液體受試物陽(yáng)性物質(zhì)，0.9%氯化鈉注射液作為陰性對(duì)照。按照OECD437推薦液體陽(yáng)性化合物除N，N-二甲基甲酰胺外，還可以選擇無(wú)水乙醇，但是根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室歷史數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)采用牛角膜通透性和滲透性試驗(yàn)對(duì)無(wú)水乙醇檢測(cè)，歷史數(shù)據(jù)范圍在IVIS應(yīng)介于20.5～58.7之間，無(wú)法對(duì)根據(jù)該化合物的正確分類，因此，建議選擇分類更為明確的N，N-二甲基甲酰胺作為液體的陽(yáng)性對(duì)照。2.其他影響結(jié)果的因素在試驗(yàn)過(guò)程中，牛角膜的質(zhì)量控制是最為關(guān)鍵的，一般建議取材后的24小時(shí)內(nèi)完成試驗(yàn)，取眼球后立刻放入遇冷的緩沖液，低溫運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，同時(shí)建議加雙抗。取角膜后也應(yīng)及時(shí)放入緩沖液中，長(zhǎng)時(shí)間脫離緩沖液會(huì)影響角膜質(zhì)量。3.本方法的可行性分析本方法操作簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)所需的相關(guān)技術(shù)、人員等條件易達(dá)到，國(guó)內(nèi)濁度檢測(cè)設(shè)備成熟穩(wěn)定，一般化妝品檢測(cè)的機(jī)構(gòu)均具有建立本標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)化妝品原料的條件和能力。本方法建立過(guò)程中，通過(guò)邀請(qǐng)3家實(shí)驗(yàn)室參與了實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證，結(jié)果大體一致，表明本方法在我國(guó)實(shí)驗(yàn)室建立是可行的。4.本方法與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的比對(duì)結(jié)果由于我國(guó)現(xiàn)行的檢測(cè)化妝品急性眼刺激性/腐蝕性試驗(yàn)是整體動(dòng)物試驗(yàn)，而已納入《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中的化妝品用化學(xué)原料體外兔角膜上皮細(xì)胞短時(shí)暴露試驗(yàn)本方法適用范圍有限，主要適用于能溶于5%的DMSO/生理鹽水溶液、礦物油或可制成均勻混懸液的物質(zhì)。當(dāng)高揮發(fā)性物質(zhì)和非表面活性劑類固體物質(zhì)結(jié)果判定為無(wú)刺激性或微刺激性時(shí)，需加做其他試驗(yàn)加以判定。無(wú)法完全替代動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)化學(xué)品分類。而牛角膜通透性滲透性試驗(yàn)方法適用范圍廣，由于受試物直接暴露于角膜表面并可以開(kāi)窗加樣，該方法不但滿足各類原料的檢測(cè)，包括表面活性劑，乳類，蠟類，醇類等受試物檢測(cè)的需求，還可以用于檢測(cè)各類配方和產(chǎn)品。因此，牛角膜通透性滲透性試驗(yàn)方法是兔角膜上皮細(xì)胞短時(shí)暴露試驗(yàn)方法很好