銀杏MYB家族基因克隆

及功能驗(yàn)證

——試驗(yàn)進(jìn)度報告匯報人高云鵬一、目錄前期實(shí)驗(yàn)：對克隆R2R3-MYB目的基因的篩選；銀杏葉mRNA的提取及cDNA的合成；近期實(shí)驗(yàn)：1、培養(yǎng)銀杏愈傷組織、扦插苗等無性系；2、對銀杏愈傷組織進(jìn)行脅迫處理3、用熒光定量PCR檢測脅迫處理后R2R3-MYB基因表達(dá)量4、R2R3-MYB基因的克隆目的基因的克隆及其原核表達(dá)技術(shù)路線RNAExtractionVectorTVectorTPCRProductAApET-HEHEHEVRT-PCR轉(zhuǎn)化DE3HE蛋白ITPG誘導(dǎo)大腸桿菌R2R3-MYB目的基因的篩選MYB蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域集中在氨基端，每個重復(fù)區(qū)含有3個在空間上規(guī)則排列的色氨酸殘基，這3個色氨酸殘基在折疊形成MYB結(jié)構(gòu)域的疏水核中起重要作用，一般在所有的MYB蛋白中是保守的，但R3的第1色氨酸殘基被芳香族氨基酸(如苯丙氨酸)或他疏水氨基酸所代替PLVSSI-FCEIIFFNAAIGRWFMQQISNIDHGCPLLSVIEGRP-AYCCNMRSGPSKFSYKTTEYICLLSLSGSGKLERKRAYKCN-SLFLVCGSRKVVQKQQIRRGLCTELQVLGKY-QKVSQGSF-GSAVMGRAPCCDKNGLRKGPWTPEEDQKLNDYIQRHGHGSWRALPKHAGLLRCGKSCRLRWTNYLRPDVKRGKFSFAEEQTIIQLHGVLGNKWSAIAAQLPGRTDNEIKNYWNTHLKKRLRQMGIDPVTHRPRIDLFDFSNMTRFFAPATLSHMSAHWANARLEALTREYLRLAAWRSAAMIGDQQNGTQADTLIIRSKLGADAFCRPDINAHVTAPHPNNWGQNPEIGTVTCSGSDEQIMLGKHADNSEQFQ-銀杏葉mRNA的提取mRNA提取注意事項(xiàng)：1、銀杏葉mRNA提取其使用的的所有槍頭、離心管都要經(jīng)過嚴(yán)格的滅mRNA酶的活性。2、銀杏葉mRNA提取過程中，樣品必須始終在液氮的低溫保護(hù)中，防止銀杏葉mRNA在研磨中快速降解。RT-PCR基本原理：將細(xì)胞中mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。mRNAcDNAPCR產(chǎn)物PCR引物設(shè)計的目的：

找到一對合適的核苷酸片段，使其能夠有效的擴(kuò)增模板DNA。引物設(shè)計目的和PCR擴(kuò)增引物常用PCR擴(kuò)增的體系（25μL）和條件程序：95℃變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s，30個循環(huán)；72℃延伸10minddH2O19μL上游引物2μL下游引物2μL模板

2μL2XTaqMasterMix25μL→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物設(shè)計的原則1.引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)；避開產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)區(qū)。自由能△G°≥58.6lkJ/mol。3.引物長度一般在15~30堿基之間。4.G+C含量在40%~60%之間。5.堿基要隨機(jī)分布。6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基互補(bǔ)，引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)

7.引物5′端可以修飾；引物3′端不可修飾。8.引物3′端要避開密碼子的第3位。電泳圖目的基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌RecombinantDNA

DNAligasevector1目的基因?qū)爰?xì)胞的方法氯化鈣法：利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細(xì)胞，促進(jìn)外源DNA的進(jìn)入。宿主細(xì)胞與重組DNA在00C的氯化鈣溶液中孵育，快速轉(zhuǎn)入420C造成熱休克。經(jīng)此處理后的細(xì)胞“容易”接受外源的DNA，一般叫做感受態(tài)細(xì)胞。處理宿主細(xì)胞

1低滲溶液＋熱休克

E.coli+0.1MCaCl2

competent(E.coli)cells

被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞Low-osmosismakescellexpanding0-4℃RecombinantDNA+42℃Heatmakescellmoreexpandingandmembranemorepermeable

處于感受態(tài)的細(xì)菌表面正電荷增加，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)有改變，通透性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子易于進(jìn)入細(xì)胞。

質(zhì)粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，在宿主細(xì)胞內(nèi)該抗性基因表達(dá)出可水解氨芐青霉素的酶，因而宿主細(xì)胞可在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長。利用抗生素抗性對重組子篩選對銀杏愈傷組織進(jìn)行脅迫處理

各種脅迫處理對R2R3-MYB基因表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)因素和水平ABA（100μM）NaCl（200μM)dehydrationcold（