一、引言1.1研究背景與意義細(xì)胞周期的精準(zhǔn)調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞正常功能和生物體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。周期蛋白依賴性激酶（Cyclin-DependentKinases，CDK）作為細(xì)胞周期調(diào)控的核心元件，在細(xì)胞周期進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色。CDK家族包含多個(gè)成員，如CDK1-9等，它們通過與相應(yīng)的周期蛋白（Cyclin）結(jié)合形成復(fù)合物，激活后磷酸化特定底物，從而驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期從一個(gè)階段有序過渡到下一個(gè)階段。例如，CDK4/6與細(xì)胞周期蛋白D（CycD）結(jié)合，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，開啟DNA復(fù)制；CDK1與細(xì)胞周期蛋白B結(jié)合，推動(dòng)細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期，完成細(xì)胞分裂。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，CDK活性的失調(diào)是一個(gè)普遍且關(guān)鍵的特征。大量研究表明，多種腫瘤細(xì)胞中存在CDK異常激活的現(xiàn)象，這主要源于細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，CDK4/6常常過度表達(dá)或活性異常增強(qiáng)，這使得細(xì)胞周期進(jìn)程失控，細(xì)胞能夠持續(xù)增殖、逃避凋亡，并獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力。在小細(xì)胞肺癌中，RB1基因的突變/缺失打破了細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的平衡，導(dǎo)致CDK4/6信號(hào)通路異常激活，細(xì)胞分裂不再受正常的增殖和抑制信號(hào)控制。這種CDK活性的異常變化為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活提供了有利條件，使其能夠在體內(nèi)不斷增殖和擴(kuò)散，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。鑒于CDK在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，研發(fā)選擇性CDK抑制劑成為腫瘤治療領(lǐng)域的重要研究方向。選擇性CDK抑制劑能夠特異性地作用于腫瘤細(xì)胞中異常激活的CDK，通過抑制其活性，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)其凋亡的目的。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，選擇性CDK抑制劑具有更高的特異性和靶向性，能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，降低治療過程中的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量和治療依從性。目前，在乳腺癌治療領(lǐng)域，CDK4/6抑制劑已經(jīng)取得了顯著的臨床成果。以帕博西尼、瑞博西尼、阿貝西利和曲拉西利等為代表的CDK4/6抑制劑已獲得FDA批準(zhǔn)上市，并廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐。這些抑制劑與內(nèi)分泌治療聯(lián)合使用，顯著改善了HR+/HER2-晚期乳腺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）和總生存期（OS）。例如，在PALOMA-2研究中，哌柏西利聯(lián)合來(lái)曲唑一線治療ER+/HER2-晚期乳腺癌，較安慰劑聯(lián)合來(lái)曲唑顯著延長(zhǎng)了中位PFS（27.6個(gè)月vs14.5個(gè)月）。然而，現(xiàn)有CDK抑制劑仍存在一些局限性，如部分患者對(duì)藥物的耐藥性問題，以及在其他腫瘤類型中的療效仍有待進(jìn)一步提高等。因此，持續(xù)研發(fā)新型、高效、低毒且具有良好選擇性的CDK抑制劑，對(duì)于滿足腫瘤患者的臨床需求、推動(dòng)腫瘤治療的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的生物學(xué)特性，通過創(chuàng)新的藥物設(shè)計(jì)理念和先進(jìn)的技術(shù)手段，研發(fā)出具有高度選擇性、高效性和低毒性的新型CDK抑制劑，為腫瘤治療提供更具潛力的治療策略。在當(dāng)前的研究中，雖然已經(jīng)取得了一定的成果，但在研發(fā)選擇性CDK抑制劑的過程中仍面臨著諸多關(guān)鍵問題。選擇性是研發(fā)過程中面臨的首要挑戰(zhàn)。CDK家族成員眾多，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上存在一定的相似性，這使得開發(fā)能夠特異性作用于目標(biāo)CDK，而對(duì)其他CDK亞型影響較小的抑制劑成為難題。例如，CDK4和CDK6的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域高度相似，僅在個(gè)別氨基酸殘基上存在差異（如CDK4中的Glu144和CDK6中的Gln149），這就要求抑制劑在設(shè)計(jì)時(shí)能夠精準(zhǔn)識(shí)別這些細(xì)微差別，以實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK4/6的高選擇性抑制。如果抑制劑的選擇性不足，可能會(huì)對(duì)正常細(xì)胞中其他CDK的功能產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致不必要的副作用，影響患者的治療體驗(yàn)和生活質(zhì)量。耐藥性是另一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。隨著CDK抑制劑在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，部分患者逐漸出現(xiàn)對(duì)藥物的耐藥現(xiàn)象，使得治療效果大打折扣。耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，可能涉及腫瘤細(xì)胞通過基因突變、信號(hào)通路的代償性激活等方式來(lái)逃避CDK抑制劑的作用。以乳腺癌治療為例，長(zhǎng)期使用CDK4/6抑制劑可能導(dǎo)致ER信號(hào)通路的改變，或者細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其他關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的異常變化，從而使腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生抗性，繼續(xù)增殖和發(fā)展。深入研究耐藥機(jī)制，尋找有效的克服耐藥性的方法，對(duì)于提高CDK抑制劑的長(zhǎng)期療效至關(guān)重要。藥物的安全性和有效性也是需要重點(diǎn)關(guān)注的方面。在保證對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著抑制作用的同時(shí)，如何確保CDK抑制劑對(duì)正常組織和細(xì)胞的毒性最小化，是研發(fā)過程中必須平衡的關(guān)鍵因素。目前一些已上市的CDK抑制劑在治療過程中仍會(huì)引發(fā)如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)，這限制了藥物的使用劑量和治療周期，影響了患者的治療依從性和整體治療效果。此外，如何優(yōu)化藥物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，提高藥物在腫瘤組織中的富集程度，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性，也是提升藥物有效性的重要研究方向。綜上所述，本研究將圍繞解決這些關(guān)鍵問題展開，通過多學(xué)科交叉的研究方法，從分子機(jī)制、藥物設(shè)計(jì)、藥理毒理等多個(gè)層面深入探索，致力于突破現(xiàn)有瓶頸，為選擇性CDK抑制劑的研發(fā)提供新的思路和方法，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的研究方法，從多個(gè)維度深入開展對(duì)選擇性CDK抑制劑的研發(fā)工作。在分子生物學(xué)與生物化學(xué)層面，借助基因編輯技術(shù)如CRISPR-Cas9，構(gòu)建CDK基因敲除或過表達(dá)的細(xì)胞模型，深入探究CDK在細(xì)胞周期調(diào)控中的分子機(jī)制，明確其與上下游信號(hào)通路的相互作用關(guān)系。通過蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲取高純度的CDK蛋白，運(yùn)用X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法，解析CDK的三維結(jié)構(gòu)，特別是其與ATP結(jié)合位點(diǎn)以及與周期蛋白結(jié)合區(qū)域的結(jié)構(gòu)特征，為后續(xù)的藥物設(shè)計(jì)提供精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)信息。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等技術(shù)，檢測(cè)CDK的活性變化以及相關(guān)底物蛋白的磷酸化水平，量化分析CDK在不同條件下的生物學(xué)功能。在藥物設(shè)計(jì)與篩選領(lǐng)域，采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）技術(shù)，基于前期解析的CDK結(jié)構(gòu)，運(yùn)用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，在虛擬化合物庫(kù)中篩選出具有潛在活性的小分子化合物，作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。結(jié)合高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)大量候選化合物進(jìn)行快速的活性篩選和初步的成藥性評(píng)價(jià)，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、凋亡檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)，評(píng)估化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響，篩選出具有較強(qiáng)抑制活性和較好選擇性的化合物。利用基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)（FBDD）策略，以小分子片段為起始點(diǎn)，通過片段生長(zhǎng)、片段連接等方法，逐步優(yōu)化化合物的結(jié)構(gòu)，提高其與CDK的親和力和選擇性。在藥理毒理學(xué)研究方面，建立多種腫瘤動(dòng)物模型，如人源腫瘤細(xì)胞異種移植（PDX）模型和基因工程小鼠腫瘤模型，評(píng)價(jià)候選抑制劑在體內(nèi)的抗腫瘤效果，包括腫瘤體積變化、生存期延長(zhǎng)等指標(biāo)。運(yùn)用藥代動(dòng)力學(xué)（PK）和藥效動(dòng)力學(xué)（PD）研究方法，分析藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程，以及藥物濃度與藥效之間的關(guān)系，優(yōu)化藥物的給藥方案。通過血液學(xué)、生化指標(biāo)檢測(cè)以及組織病理學(xué)檢查，全面評(píng)估候選抑制劑的安全性和毒副作用，確保藥物在治療劑量下具有良好的安全性。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：多靶點(diǎn)協(xié)同設(shè)計(jì)理念：突破傳統(tǒng)的單一CDK靶點(diǎn)抑制思路，提出多靶點(diǎn)協(xié)同抑制的設(shè)計(jì)理念。通過深入研究細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)多個(gè)關(guān)鍵CDK靶點(diǎn)之間的協(xié)同作用關(guān)系，設(shè)計(jì)能夠同時(shí)作用于多個(gè)CDK靶點(diǎn)的抑制劑，以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞更全面、更有效的抑制，同時(shí)減少因單一靶點(diǎn)抑制導(dǎo)致的耐藥性問題?；谌斯ぶ悄艿乃幬镌O(shè)計(jì)優(yōu)化：充分利用人工智能技術(shù)，如深度學(xué)習(xí)算法，對(duì)大量的化合物結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和學(xué)習(xí)，構(gòu)建精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)模型。通過該模型對(duì)先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和活性預(yù)測(cè)，快速篩選出具有最優(yōu)成藥性的候選化合物，大大提高藥物研發(fā)的效率和成功率。與傳統(tǒng)的藥物設(shè)計(jì)方法相比，人工智能技術(shù)能夠更快速、準(zhǔn)確地挖掘潛在的藥物分子，為CDK抑制劑的研發(fā)提供新的技術(shù)手段。生物標(biāo)志物導(dǎo)向的精準(zhǔn)治療策略：致力于尋找與CDK抑制劑療效相關(guān)的生物標(biāo)志物，通過對(duì)腫瘤患者的基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出能夠預(yù)測(cè)患者對(duì)CDK抑制劑治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物?；谶@些生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的精準(zhǔn)分層，為不同患者制定個(gè)性化的治療方案，提高治療的針對(duì)性和有效性，減少不必要的治療和副作用。二、CDK抑制劑的作用機(jī)制與研究現(xiàn)狀2.1CDK家族成員及功能細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）家族包含多個(gè)成員，它們?cè)诩?xì)胞的生命活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，主要可分為參與細(xì)胞周期調(diào)控和參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)這兩大類別，不同類別的CDK成員通過各自獨(dú)特的機(jī)制，維持著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和正常生理功能的執(zhí)行。2.1.1參與細(xì)胞周期調(diào)控的CDK成員在細(xì)胞周期調(diào)控過程中，CDK1、CDK2、CDK4、CDK6等成員扮演著關(guān)鍵角色，它們與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）相互作用，形成復(fù)合物，精準(zhǔn)地調(diào)控細(xì)胞周期的各個(gè)階段。CDK1是細(xì)胞周期調(diào)控的核心成員之一，它主要與細(xì)胞周期蛋白B（CyclinB）結(jié)合，形成的CDK1-CyclinB復(fù)合物在細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在G2期，CDK1-CyclinB復(fù)合物逐漸積累并被激活，它通過磷酸化一系列底物蛋白，如核纖層蛋白、組蛋白H1等，促使染色質(zhì)凝集、核膜破裂，進(jìn)而啟動(dòng)有絲分裂過程。研究表明，在爪蟾卵提取物中，當(dāng)CDK1-CyclinB復(fù)合物被抑制時(shí)，細(xì)胞無(wú)法正常進(jìn)入M期，有絲分裂過程被阻斷。這充分說(shuō)明了CDK1在細(xì)胞周期G2/M期轉(zhuǎn)換中的關(guān)鍵作用，它是確保細(xì)胞有絲分裂正常進(jìn)行的重要調(diào)控因子。CDK2在細(xì)胞周期調(diào)控中也具有重要作用，它主要參與細(xì)胞周期的S期和M期進(jìn)程。在G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)，CDK2與細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），使Rb釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而激活一系列與DNA復(fù)制相關(guān)的基因表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。進(jìn)入S期后，CDK2又與細(xì)胞周期蛋白A（CyclinA）結(jié)合，繼續(xù)參與DNA復(fù)制和細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控。在M期，CDK2-CyclinA復(fù)合物也參與了染色體的凝聚和紡錘體的組裝等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，敲低CDK2基因會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1/S期，DNA復(fù)制無(wú)法正常進(jìn)行，這表明CDK2對(duì)于細(xì)胞周期的正常推進(jìn)至關(guān)重要。CDK4和CDK6在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的重要調(diào)控因子。CDK4/6能夠與細(xì)胞周期蛋白D（CyclinD）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過磷酸化Rb蛋白，使Rb蛋白喪失對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制作用，從而釋放E2F，激活E2F靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在多種腫瘤細(xì)胞中，如乳腺癌、黑色素瘤等，CDK4/6-CyclinD復(fù)合物常常過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞異常增殖。以乳腺癌為例，研究表明，在約70%的HR+/HER2-乳腺癌患者中，存在CDK4/6的過表達(dá)或異常激活，這使得細(xì)胞能夠繞過正常的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，持續(xù)增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。2.1.2參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的CDK成員除了參與細(xì)胞周期調(diào)控，CDK家族中的一些成員還在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用，其中包括CDK7、CDK8、CDK9、CDK10、CDK11等。CDK7是一種多功能的CDK，它在細(xì)胞周期調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中都具有重要作用。在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方面，CDK7是轉(zhuǎn)錄起始因子TFIIH的組成部分，它能夠磷酸化RNA聚合酶II（RNAPII）的C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）中的絲氨酸5位點(diǎn)（Ser5），從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄起始過程。此外，CDK7還可以激活其他CDK成員，如CDK1、CDK2、CDK4和CDK6等，間接參與細(xì)胞周期的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，在人類細(xì)胞中，抑制CDK7的活性會(huì)導(dǎo)致RNAPII的Ser5磷酸化水平降低，轉(zhuǎn)錄起始受到抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖也受到影響。CDK8主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，它與細(xì)胞周期蛋白C（CyclinC）結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能夠與轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物相互作用，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。CDK8通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子和其他轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，影響轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組裝和活性，從而調(diào)控基因的表達(dá)。在腫瘤發(fā)生過程中，CDK8的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。例如，在結(jié)直腸癌中，CDK8的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。CDK9在轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它是正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）的催化亞基，與細(xì)胞周期蛋白T（CyclinT）結(jié)合形成復(fù)合物。CDK9-CyclinT復(fù)合物能夠磷酸化RNAPII的CTD中的絲氨酸2位點(diǎn)（Ser2），以及負(fù)性轉(zhuǎn)錄延伸因子（NELF）和DRB敏感性誘導(dǎo)因子（DSIF），從而解除轉(zhuǎn)錄延伸的阻滯，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的有效延伸。在腫瘤細(xì)胞中，CDK9的過度激活會(huì)導(dǎo)致抗凋亡基因和增殖相關(guān)基因的高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖。例如，在白血病細(xì)胞中，抑制CDK9的活性可以下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。CDK10和CDK11也參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，它們?cè)诓煌募?xì)胞生理狀態(tài)下，通過與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白的活性，影響基因的表達(dá)。雖然目前對(duì)于CDK10和CDK11在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的具體機(jī)制和功能研究還相對(duì)較少，但已有研究表明，它們?cè)诩?xì)胞的生長(zhǎng)、分化和腫瘤發(fā)生等過程中可能發(fā)揮著重要作用。例如，在一些腫瘤細(xì)胞系中，敲低CDK11的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞周期發(fā)生改變，這提示CDK11可能參與了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控過程。2.2CDK在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，CDK活性的改變扮演著至關(guān)重要的角色，其主要通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、影響細(xì)胞增殖與凋亡平衡以及參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等多個(gè)方面，推動(dòng)腫瘤的形成和惡化。2.2.1細(xì)胞周期調(diào)控異常細(xì)胞周期的正常調(diào)控是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞周期受到嚴(yán)格的監(jiān)控，各個(gè)階段有序進(jìn)行。然而，在腫瘤細(xì)胞中，CDK的異常激活或表達(dá)常常導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂。以乳腺癌為例，在HR+/HER2-乳腺癌中，CDK4/6的過表達(dá)或異常激活是一個(gè)常見的現(xiàn)象。正常情況下，CDK4/6與CyclinD結(jié)合形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期的G1期，該復(fù)合物通過磷酸化Rb蛋白，使Rb蛋白釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而啟動(dòng)細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期。但在乳腺癌細(xì)胞中，由于CDK4/6的過度激活，使得這一調(diào)控過程失控，細(xì)胞能夠持續(xù)進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖。研究表明，在約70%的HR+/HER2-乳腺癌患者中，存在CDK4/6的過表達(dá)，這使得腫瘤細(xì)胞能夠繞過正常的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，不斷增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，CDK1的異常激活也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CDK1主要與CyclinB結(jié)合，在細(xì)胞周期的G2/M期轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在NSCLC細(xì)胞中，由于多種因素的影響，如基因的突變、信號(hào)通路的異常激活等，導(dǎo)致CDK1-CyclinB復(fù)合物的活性異常升高，使得細(xì)胞能夠快速通過G2/M期，進(jìn)入有絲分裂過程。這種細(xì)胞周期進(jìn)程的加速，使得腫瘤細(xì)胞能夠迅速增殖，形成腫瘤組織。同時(shí)，CDK1的異常激活還會(huì)影響細(xì)胞的染色體穩(wěn)定性，增加染色體畸變的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。2.2.2細(xì)胞增殖與凋亡失衡CDK不僅參與細(xì)胞周期的調(diào)控，還在細(xì)胞增殖和凋亡的平衡中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，細(xì)胞的增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，以維持組織和器官的正常功能。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，CDK活性的改變會(huì)打破這種平衡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖過度而凋亡受阻。在結(jié)直腸癌中，CDK8的異常表達(dá)與細(xì)胞增殖和凋亡失衡密切相關(guān)。CDK8主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程，它與CyclinC結(jié)合形成復(fù)合物，能夠調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。在結(jié)直腸癌中，CDK8的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活。Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程中具有重要作用，其異常激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。具體來(lái)說(shuō)，CDK8-CyclinC復(fù)合物通過磷酸化Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，如β-連環(huán)蛋白（β-catenin）等，使其穩(wěn)定性增加，從而進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如c-Myc、CyclinD1等。同時(shí)，CDK8的過表達(dá)還會(huì)抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如Bax等，使得細(xì)胞凋亡受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。在白血病中，CDK9的過度激活也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖與凋亡失衡。CDK9是P-TEFb的催化亞基，在轉(zhuǎn)錄延伸過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在白血病細(xì)胞中，CDK9的過度激活會(huì)導(dǎo)致抗凋亡基因和增殖相關(guān)基因的高表達(dá)。例如，CDK9能夠磷酸化RNAPII的CTD中的Ser2位點(diǎn)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Mcl-1的轉(zhuǎn)錄延伸，使其表達(dá)水平升高。Mcl-1是一種重要的抗凋亡蛋白，它能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)，CDK9的過度激活還會(huì)促進(jìn)其他增殖相關(guān)基因的表達(dá)，如CyclinD1等，進(jìn)一步促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖。這種細(xì)胞增殖與凋亡失衡，使得白血病細(xì)胞能夠在體內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致病情的惡化。2.2.3腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移除了調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程和影響細(xì)胞增殖與凋亡平衡外，CDK還參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，這是腫瘤惡化和導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要因素。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CDK4/6的活性與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。當(dāng)CDK4/6被異常激活時(shí)，腫瘤細(xì)胞能夠通過一系列機(jī)制獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。一方面，CDK4/6的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架的重塑。細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的重要結(jié)構(gòu)，其重塑能夠改變細(xì)胞的形態(tài)和遷移能力。CDK4/6通過磷酸化細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白等，使得細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。另一方面，CDK4/6的激活還會(huì)影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生存的微環(huán)境，腫瘤細(xì)胞需要降解細(xì)胞外基質(zhì)才能實(shí)現(xiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移。CDK4/6通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)和活性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。在肝癌中，CDK2的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移也存在關(guān)聯(lián)。CDK2在細(xì)胞周期的S期和M期發(fā)揮重要作用，在肝癌細(xì)胞中，CDK2的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期的異常調(diào)節(jié)，同時(shí)還會(huì)影響一些與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明，CDK2的過表達(dá)會(huì)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，該信號(hào)通路在細(xì)胞的生存、增殖、遷移和侵襲等過程中具有重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞中一些侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的下調(diào)和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的上調(diào)，這種上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程使得肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。此外，CDK2還可能通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如Ras/MAPK信號(hào)通路等，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.3已上市CDK抑制劑的概況目前，臨床上已經(jīng)有多款CDK4/6抑制劑獲批上市，如哌柏西利、瑞波西利、阿貝西利等，它們?cè)谀[瘤治療領(lǐng)域尤其是乳腺癌治療中發(fā)揮著重要作用，顯著改變了HR+/HER2-晚期乳腺癌的治療格局。哌柏西利（Palbociclib）由輝瑞公司研發(fā)，是全球首個(gè)獲批上市的CDK4/6抑制劑，于2015年2月獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。其作用機(jī)制是通過選擇性抑制CDK4/6，阻斷細(xì)胞周期從G1期到S期的進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在臨床應(yīng)用方面，哌柏西利主要用于治療HR+/HER2-局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。多項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)證實(shí)了其顯著的療效，如PALOMA-2研究，該研究納入了666例HR+/HER2-晚期乳腺癌患者，隨機(jī)分為哌柏西利聯(lián)合來(lái)曲唑組和安慰劑聯(lián)合來(lái)曲唑組。結(jié)果顯示，哌柏西利聯(lián)合來(lái)曲唑組的中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）達(dá)到了27.6個(gè)月，而安慰劑聯(lián)合來(lái)曲唑組僅為14.5個(gè)月，哌柏西利聯(lián)合來(lái)曲唑組的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低了44%。此外，在PALOMA-3研究中，哌柏西利聯(lián)合氟維司群用于治療經(jīng)內(nèi)分泌治療后復(fù)發(fā)或進(jìn)展的HR+/HER2-晚期乳腺癌患者，與安慰劑聯(lián)合氟維司群組相比，中位PFS顯著延長(zhǎng)（11.2個(gè)月vs4.6個(gè)月）。這些研究結(jié)果表明，哌柏西利與內(nèi)分泌治療聯(lián)合使用，能夠顯著延長(zhǎng)HR+/HER2-晚期乳腺癌患者的無(wú)進(jìn)展生存期，提高患者的生存質(zhì)量。瑞波西利（Ribociclib）由諾華公司研發(fā)，于2017年3月獲FDA批準(zhǔn)上市。它同樣通過抑制CDK4/6的活性，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，發(fā)揮抗腫瘤作用。在臨床應(yīng)用中，瑞波西利主要與芳香化酶抑制劑聯(lián)用，用于治療絕經(jīng)后HR+/HER2-的晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌。MONALEESA-2研究評(píng)估了瑞波西利聯(lián)合來(lái)曲唑?qū)Ρ劝参縿┞?lián)合來(lái)曲唑一線治療絕經(jīng)后HR+/HER2-晚期乳腺癌的療效和安全性。研究結(jié)果顯示，瑞波西利聯(lián)合來(lái)曲唑組的中位PFS達(dá)到了25.3個(gè)月，顯著長(zhǎng)于安慰劑聯(lián)合來(lái)曲唑組的16.0個(gè)月，疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)降低了44%。在MONALEESA-7研究中，瑞波西利聯(lián)合內(nèi)分泌治療用于絕經(jīng)前或圍絕經(jīng)期HR+/HER2-晚期乳腺癌患者，結(jié)果顯示，與安慰劑聯(lián)合內(nèi)分泌治療組相比，瑞波西利聯(lián)合內(nèi)分泌治療組的中位PFS和總生存期（OS）均有顯著改善，中位PFS分別為23.8個(gè)月和13.0個(gè)月，OS分別為未達(dá)到和40.9個(gè)月。這些數(shù)據(jù)表明，瑞波西利在絕經(jīng)前、圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后HR+/HER2-晚期乳腺癌患者中均顯示出良好的療效，能夠有效延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間。阿貝西利（Abemaciclib）由禮來(lái)公司研發(fā)，于2017年9月獲FDA批準(zhǔn)上市。阿貝西利不僅可以抑制CDK4/6，還對(duì)其他一些激酶具有一定的抑制作用，這種多靶點(diǎn)的作用方式可能為其帶來(lái)獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)。在臨床應(yīng)用上，阿貝西利的適應(yīng)癥較為廣泛，可與芳香化酶抑制劑聯(lián)用，作為HR+/HER2-晚期乳腺癌患者的初始內(nèi)分泌治療；也可與氟維司群聯(lián)用，治療HR+/HER2-晚期乳腺癌患者；此外，還可用于HR+/HER2-部分早期乳腺癌的治療。MONARCH-3研究評(píng)估了阿貝西利聯(lián)合芳香化酶抑制劑一線治療HR+/HER2-晚期乳腺癌的療效，結(jié)果顯示，阿貝西利聯(lián)合芳香化酶抑制劑組的中位PFS為28.18個(gè)月，顯著優(yōu)于安慰劑聯(lián)合芳香化酶抑制劑組的14.76個(gè)月。在MONARCH-2研究中，阿貝西利聯(lián)合氟維司群用于治療HR+/HER2-晚期乳腺癌患者，與安慰劑聯(lián)合氟維司群組相比，中位PFS顯著延長(zhǎng)（16.4個(gè)月vs9.3個(gè)月）。此外，基于MonarchE研究，阿貝西利聯(lián)合內(nèi)分泌治療用于HR+/HER2-高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的早期乳腺癌患者，顯著改善了患者的無(wú)浸潤(rùn)性疾病生存期（iDFS），2年iDFS率分別為92.2%和88.7%。這些研究表明，阿貝西利在HR+/HER2-晚期和早期乳腺癌的治療中均具有顯著的療效，能夠?yàn)椴煌A段的患者帶來(lái)生存獲益。三、選擇性CDK抑制劑研發(fā)策略3.1基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)3.1.1靶向ATP結(jié)合口袋ATP結(jié)合口袋是CDK發(fā)揮激酶活性的關(guān)鍵區(qū)域，也是目前大多數(shù)CDK抑制劑的作用靶點(diǎn)。該口袋位于CDK蛋白的催化結(jié)構(gòu)域，具有高度保守的結(jié)構(gòu)特征，由多個(gè)氨基酸殘基組成，這些殘基形成了一個(gè)特定的空間結(jié)構(gòu)，能夠特異性地結(jié)合ATP分子，并為激酶活性的發(fā)揮提供必要的環(huán)境。由于CDK家族成員的ATP結(jié)合口袋在結(jié)構(gòu)上存在一定的相似性，這為開發(fā)選擇性CDK抑制劑帶來(lái)了挑戰(zhàn)，但同時(shí)也為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)提供了切入點(diǎn)。基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方法主要是利用X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等技術(shù)，解析CDK蛋白與ATP或ATP類似物結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)，深入了解ATP結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征、氨基酸組成以及與ATP分子的相互作用模式。通過這些結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）技術(shù)，如分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等，在虛擬化合物庫(kù)中篩選能夠與ATP結(jié)合口袋特異性結(jié)合的小分子化合物。分子對(duì)接是將小分子化合物與CDK蛋白的ATP結(jié)合口袋進(jìn)行虛擬匹配，通過計(jì)算化合物與口袋之間的結(jié)合自由能、氫鍵相互作用、疏水相互作用等參數(shù)，評(píng)估化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合能力和選擇性。分子動(dòng)力學(xué)模擬則是在原子水平上模擬化合物與CDK蛋白的動(dòng)態(tài)相互作用過程，研究復(fù)合物的穩(wěn)定性、構(gòu)象變化以及結(jié)合模式的動(dòng)態(tài)演變，進(jìn)一步優(yōu)化化合物的設(shè)計(jì)。在CDK4/6抑制劑的研發(fā)中，基于ATP結(jié)合口袋的設(shè)計(jì)策略取得了顯著成果。例如，已上市的CDK4/6抑制劑帕博西尼（Palbociclib）、瑞波西利（Ribociclib）和阿貝西利（Abemaciclib）等，都是通過靶向CDK4/6的ATP結(jié)合口袋發(fā)揮作用。帕博西尼是一種吡啶并嘧啶類化合物，其分子結(jié)構(gòu)中的吡啶并嘧啶環(huán)能夠與CDK4/6的ATP結(jié)合口袋中的鉸鏈區(qū)氨基酸殘基形成關(guān)鍵的氫鍵相互作用，同時(shí)其環(huán)戊基部分與口袋中的疏水氨基酸殘基形成疏水相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK4/6的選擇性抑制。瑞波西利同樣含有吡啶并嘧啶支架，但其獨(dú)特的酰胺羰基取代能夠與CDK4/6的天冬氨酸殘基（Asp158/Asp163）特異性形成氫鍵，這種相互作用不僅穩(wěn)定了藥物與靶點(diǎn)的結(jié)合，而且大大提高了其對(duì)CDK4/6的選擇性。阿貝西利具有氨基吡啶支架，其分子中的咪唑基團(tuán)能夠與CDK4/6的Lys35/Lys43形成新的氫鍵，同時(shí)與腺嘌呤口袋和異丙基形成類似的氫鍵，異丙基還與核糖口袋形成疏水相互作用，這些獨(dú)特的相互作用增強(qiáng)了其對(duì)CDK4/6的選擇性，使其在臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出良好的療效。盡管基于ATP結(jié)合口袋的設(shè)計(jì)策略在CDK抑制劑研發(fā)中取得了一定成功，但仍存在一些局限性。一方面，由于CDK家族成員ATP結(jié)合口袋的相似性，難以完全避免對(duì)其他CDK亞型的抑制，從而可能導(dǎo)致副作用的產(chǎn)生。另一方面，長(zhǎng)期使用該類抑制劑可能會(huì)引發(fā)腫瘤細(xì)胞的耐藥性，這可能與腫瘤細(xì)胞通過基因突變改變ATP結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)，或者激活其他代償性信號(hào)通路有關(guān)。因此，在未來(lái)的研發(fā)中，需要進(jìn)一步深入研究ATP結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征和功能，結(jié)合其他技術(shù)手段，如共價(jià)結(jié)合技術(shù)、片段藥物設(shè)計(jì)等，開發(fā)更加高效、低毒且具有高選擇性的CDK抑制劑。3.1.2變構(gòu)抑制劑的設(shè)計(jì)變構(gòu)抑制劑是一類通過結(jié)合在靶蛋白的變構(gòu)位點(diǎn)，引起蛋白構(gòu)象改變，從而影響其活性的小分子化合物。與傳統(tǒng)的靶向ATP結(jié)合口袋的抑制劑不同，變構(gòu)抑制劑具有獨(dú)特的作用機(jī)制和優(yōu)勢(shì)。變構(gòu)位點(diǎn)通常位于蛋白的非活性中心區(qū)域，與ATP結(jié)合口袋相距較遠(yuǎn)，其結(jié)構(gòu)和氨基酸組成在不同的CDK家族成員之間存在較大差異。這使得變構(gòu)抑制劑能夠特異性地作用于目標(biāo)CDK，減少對(duì)其他CDK亞型的干擾，從而提高抑制劑的選擇性。變構(gòu)抑制劑通過誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象的改變來(lái)調(diào)節(jié)其活性，這種作用方式與傳統(tǒng)抑制劑直接競(jìng)爭(zhēng)ATP結(jié)合口袋的方式不同，可能會(huì)產(chǎn)生一些新的生物學(xué)效應(yīng)，為克服耐藥性提供了新的途徑。變構(gòu)抑制劑的設(shè)計(jì)思路主要是基于對(duì)CDK蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入理解，通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法，尋找CDK蛋白上的變構(gòu)位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)方法包括X射線晶體學(xué)、核磁共振、氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）等，這些技術(shù)可以直接觀察蛋白在與小分子結(jié)合前后的結(jié)構(gòu)變化，從而確定變構(gòu)位點(diǎn)的位置和特征。計(jì)算方法則主要利用分子動(dòng)力學(xué)模擬、自由能計(jì)算等技術(shù)，預(yù)測(cè)CDK蛋白的潛在變構(gòu)位點(diǎn)，并分析小分子與變構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)合模式和相互作用能量。在確定變構(gòu)位點(diǎn)后，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，在虛擬化合物庫(kù)中篩選能夠與變構(gòu)位點(diǎn)特異性結(jié)合的小分子化合物，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，提高其與變構(gòu)位點(diǎn)的親和力和選擇性。目前，變構(gòu)抑制劑的研發(fā)取得了一定的進(jìn)展。例如，在CDK2的研究中，通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和動(dòng)態(tài)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于CDK2蛋白表面的潛在變構(gòu)口袋?；诖?，設(shè)計(jì)并合成了一系列多肽抑制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些多肽抑制劑能夠與變構(gòu)口袋結(jié)合，部分分解CDK2/Cyclin復(fù)合物，并降低其激酶活性。在CDK9的研究中，通過基于網(wǎng)絡(luò)的變構(gòu)口袋探測(cè)方法，篩選出了靶向TL-pocket的變構(gòu)抑制劑F07#13。理論計(jì)算和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，F(xiàn)07#13能夠特異性地結(jié)合到CDK9的TL-pocket，降低CDK9的激酶活性，且對(duì)CDK2、CDK4、CDK6等其他CDK亞型具有較高的選擇性。盡管變構(gòu)抑制劑具有潛在的優(yōu)勢(shì)，但在研發(fā)過程中仍面臨一些挑戰(zhàn)。變構(gòu)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證較為困難，需要綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)和計(jì)算技術(shù)，且結(jié)果的可靠性和重復(fù)性有待提高。變構(gòu)抑制劑與變構(gòu)位點(diǎn)的結(jié)合親和力通常較弱，需要進(jìn)行深入的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和藥物設(shè)計(jì)，以提高其活性和療效。變構(gòu)抑制劑的作用機(jī)制較為復(fù)雜，對(duì)其在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)和信號(hào)通路的影響還需要進(jìn)一步深入研究。因此，未來(lái)需要加強(qiáng)對(duì)變構(gòu)抑制劑的研究，不斷探索新的設(shè)計(jì)方法和技術(shù)手段，以克服這些挑戰(zhàn)，推動(dòng)變構(gòu)抑制劑的臨床應(yīng)用。3.2共價(jià)抑制劑的研發(fā)3.2.1共價(jià)結(jié)合的原理與優(yōu)勢(shì)共價(jià)結(jié)合是指抑制劑與靶蛋白之間通過形成共價(jià)鍵的方式相互作用，這種結(jié)合方式具有獨(dú)特的原理和顯著的優(yōu)勢(shì)，在CDK抑制劑研發(fā)中展現(xiàn)出重要的應(yīng)用潛力。共價(jià)結(jié)合的原理基于化學(xué)反應(yīng)中的親核-親電反應(yīng)機(jī)制。在CDK蛋白的活性位點(diǎn)或附近，通常存在一些具有親核性的氨基酸殘基，如半胱氨酸（Cys）的巰基（-SH）、絲氨酸（Ser）和蘇氨酸（Thr）的羥基（-OH）等。這些親核性殘基能夠與抑制劑分子中具有親電性的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。例如，丙烯酰胺、馬來(lái)酰亞胺等親電基團(tuán)可以與半胱氨酸的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。以CDK4/6為例，其活性位點(diǎn)附近的某些半胱氨酸殘基可以作為親核試劑，與含有合適親電基團(tuán)的抑制劑發(fā)生共價(jià)結(jié)合，從而改變CDK4/6的結(jié)構(gòu)和活性。與傳統(tǒng)的非共價(jià)抑制劑相比，共價(jià)抑制劑具有多方面的優(yōu)勢(shì)。共價(jià)結(jié)合通常具有較高的親和力和特異性。一旦抑制劑與靶蛋白形成共價(jià)鍵，這種結(jié)合力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于非共價(jià)相互作用，如氫鍵、范德華力等。這使得共價(jià)抑制劑能夠更緊密地結(jié)合在靶蛋白上，不易解離，從而提高了抑制劑對(duì)靶蛋白的選擇性抑制作用。共價(jià)抑制劑的作用持久性更好。由于共價(jià)鍵的穩(wěn)定性，共價(jià)抑制劑在體內(nèi)的作用時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，能夠持續(xù)抑制靶蛋白的活性，減少藥物的給藥頻率，提高患者的治療依從性。共價(jià)抑制劑還可以克服一些非共價(jià)抑制劑面臨的耐藥性問題。在腫瘤細(xì)胞中，非共價(jià)抑制劑可能會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的基因突變導(dǎo)致靶蛋白結(jié)構(gòu)改變，從而降低抑制劑與靶蛋白的結(jié)合能力，產(chǎn)生耐藥性。而共價(jià)抑制劑與靶蛋白形成的共價(jià)鍵相對(duì)穩(wěn)定，即使靶蛋白發(fā)生一些突變，也不一定會(huì)影響共價(jià)結(jié)合的穩(wěn)定性，從而有可能克服部分耐藥性。在CDK抑制劑研發(fā)中，共價(jià)結(jié)合的應(yīng)用為解決傳統(tǒng)抑制劑的局限性提供了新的思路。通過合理設(shè)計(jì)含有親電基團(tuán)的抑制劑分子，使其能夠特異性地與CDK蛋白上的特定親核氨基酸殘基發(fā)生共價(jià)結(jié)合，有望開發(fā)出具有更高選擇性和更強(qiáng)抑制活性的CDK抑制劑。然而，共價(jià)抑制劑的研發(fā)也面臨一些挑戰(zhàn)，如親電基團(tuán)的反應(yīng)活性需要精確控制，以避免與非靶蛋白發(fā)生不必要的共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致毒性增加。因此，在利用共價(jià)結(jié)合原理進(jìn)行CDK抑制劑研發(fā)時(shí)，需要綜合考慮各種因素，通過深入的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究和藥物設(shè)計(jì)優(yōu)化，充分發(fā)揮共價(jià)抑制劑的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)降低其潛在風(fēng)險(xiǎn)。3.2.2代表性共價(jià)抑制劑的研究在共價(jià)CDK抑制劑的研究領(lǐng)域，THZ1和THZ531是具有代表性的化合物，它們的研發(fā)過程和作用效果為該領(lǐng)域的發(fā)展提供了重要的參考和啟示。THZ1是一種針對(duì)CDK7的共價(jià)抑制劑，其研發(fā)過程體現(xiàn)了對(duì)CDK蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入理解以及創(chuàng)新的藥物設(shè)計(jì)理念。研究人員通過對(duì)CDK7的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)其活性位點(diǎn)附近存在一個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基Cys312?；诖?，設(shè)計(jì)了含有丙烯酰胺基團(tuán)的THZ1，該基團(tuán)能夠與Cys312的巰基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，從而不可逆地抑制CDK7的活性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，THZ1表現(xiàn)出對(duì)CDK7的高度選擇性抑制作用。它能夠有效阻斷RNA聚合酶II的磷酸化，抑制基因轉(zhuǎn)錄的起始，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的抑制效果。在多種腫瘤細(xì)胞系中，如乳腺癌、肺癌、白血病等細(xì)胞系，THZ1均能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期，抑制細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的研究表明，THZ1還可以通過抑制CDK7，間接影響其他與細(xì)胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號(hào)通路，如Rb-E2F通路、PI3K-AKT通路等，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。然而，THZ1在體內(nèi)的應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)，如藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有待優(yōu)化，以提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和生物利用度，同時(shí)需要進(jìn)一步評(píng)估其潛在的毒性和副作用。THZ531是另一種具有代表性的共價(jià)CDK抑制劑，它主要靶向CDK1和CDK2。THZ531同樣利用了共價(jià)結(jié)合的原理，通過與CDK1和CDK2活性位點(diǎn)附近的半胱氨酸殘基形成共價(jià)鍵，實(shí)現(xiàn)對(duì)這兩種CDK的特異性抑制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，THZ531能夠有效地抑制CDK1和CDK2的激酶活性，阻斷細(xì)胞周期從G2期進(jìn)入M期，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。這種作用機(jī)制使得THZ531在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。在結(jié)直腸癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞系中，THZ531能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力也有明顯的抑制作用。在動(dòng)物模型研究中，THZ531能夠有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期。與其他傳統(tǒng)的化療藥物相比，THZ531表現(xiàn)出更好的選擇性和較低的毒性，這為其進(jìn)一步的臨床開發(fā)提供了有力的支持。然而，與THZ1類似，THZ531在臨床應(yīng)用前仍需要解決一些問題，如優(yōu)化其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，提高藥物在腫瘤組織中的分布和濃度，以及深入研究其長(zhǎng)期使用的安全性和潛在的耐藥機(jī)制。THZ1和THZ531等代表性共價(jià)抑制劑的研究為共價(jià)CDK抑制劑的研發(fā)提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。它們的成功研發(fā)表明，基于共價(jià)結(jié)合原理設(shè)計(jì)的CDK抑制劑具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力，能夠?yàn)槟[瘤治療提供新的策略和藥物選擇。未來(lái)，隨著對(duì)CDK蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，以及藥物設(shè)計(jì)和合成技術(shù)的不斷發(fā)展，有望開發(fā)出更多高效、低毒且具有良好選擇性的共價(jià)CDK抑制劑，為腫瘤患者帶來(lái)更好的治療效果。3.3靶向降解策略3.3.1PROTAC技術(shù)在CDK抑制劑研發(fā)中的應(yīng)用蛋白水解靶向嵌合體（PROTAC）技術(shù)作為一種新興的藥物研發(fā)策略，近年來(lái)在CDK抑制劑研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的應(yīng)用潛力。PROTAC技術(shù)的核心原理是利用細(xì)胞內(nèi)天然的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶蛋白的降解。其分子結(jié)構(gòu)通常由三部分組成：一端是與靶蛋白（如CDK）具有特異性結(jié)合能力的配體，另一端是能夠與E3泛素連接酶特異性結(jié)合的配體，中間則通過一個(gè)合適長(zhǎng)度和化學(xué)性質(zhì)的連接臂將兩者連接起來(lái)。當(dāng)PROTAC分子進(jìn)入細(xì)胞后，其靶蛋白配體部分與CDK特異性結(jié)合，同時(shí)E3泛素連接酶配體部分與E3泛素連接酶結(jié)合，從而使CDK與E3泛素連接酶在空間上靠近。E3泛素連接酶能夠?qū)⒎核胤肿愚D(zhuǎn)移到CDK上，形成多聚泛素鏈。帶有多聚泛素鏈的CDK被蛋白酶體識(shí)別并結(jié)合，進(jìn)而被蛋白酶體降解為小分子多肽，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK的去除，阻斷其生物學(xué)功能。這種降解方式與傳統(tǒng)的CDK抑制劑通過抑制酶活性的作用機(jī)制不同，它能夠從根本上降低細(xì)胞內(nèi)CDK的蛋白水平，有可能克服傳統(tǒng)抑制劑面臨的一些局限性。在CDK抑制劑研發(fā)中，PROTAC技術(shù)具有多方面的優(yōu)勢(shì)。它能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)CDK的更徹底抑制。傳統(tǒng)的抑制劑只是抑制CDK的活性，而細(xì)胞內(nèi)仍然存在一定量的CDK蛋白，當(dāng)抑制劑濃度降低時(shí)，CDK可能重新恢復(fù)活性。而PROTAC技術(shù)可以直接降解CDK蛋白，使細(xì)胞內(nèi)CDK的水平持續(xù)降低，從而更有效地抑制其功能。PROTAC技術(shù)在解決耐藥性問題上具有潛在優(yōu)勢(shì)。由于腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)抑制劑產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制之一是通過改變靶蛋白的結(jié)構(gòu)或上調(diào)其表達(dá)來(lái)逃避抑制，而PROTAC技術(shù)直接降解CDK蛋白，即使靶蛋白發(fā)生一些突變，只要其與PROTAC分子的結(jié)合能力不受太大影響，仍然可以被降解，從而有可能克服部分耐藥性。PROTAC技術(shù)還可以賦予抑制劑額外的選擇性。對(duì)于一些結(jié)構(gòu)相似的CDK亞型，傳統(tǒng)的小分子抑制劑難以實(shí)現(xiàn)亞型選擇性，而基于非亞型選擇性小分子抑制劑開發(fā)的PROTAC分子可以通過設(shè)計(jì)不同的連接臂和E3泛素連接酶配體，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定CDK亞型的選擇性降解。目前，基于PROTAC技術(shù)的CDK抑制劑研發(fā)已經(jīng)取得了一些初步成果。研究人員開發(fā)了一系列基于CDK4/6抑制劑的雙功能降解劑（PROTAC），這些PROTAC不僅可以降解CDK4和CDK6，還能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)CDK6的選擇性降解。在HR+乳腺癌、套細(xì)胞淋巴瘤（MCL）、急性髓系白血病等疾病的臨床前模型中，CDK4/6-選擇性和CDK6-選擇性的PROTAC藥物顯示出比傳統(tǒng)CDK4/6抑制劑更高的療效。中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所的陳策實(shí)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了靶向降解CDK9的蛋白降解靶向嵌合體PROTAC-L055。在雌激素受體陽(yáng)性（ERα+）乳腺癌細(xì)胞中，L055的IC50顯著低于50nM，表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗癌潛力。L055通過連接子將目標(biāo)蛋白CDK9與E3泛素連接酶羥腦苷脂（CRBN）連接，促進(jìn)CDK9泛素化降解，明顯抑制下游靶基因c-Myc和Mcl-1的表達(dá)，顯著抑制ERα+乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和周期阻滯，為乳腺癌及其他惡性腫瘤的治療提供了新的策略。盡管PROTAC技術(shù)在CDK抑制劑研發(fā)中取得了一定進(jìn)展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。PROTAC分子的設(shè)計(jì)和優(yōu)化較為復(fù)雜，需要綜合考慮靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體以及連接臂的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，以提高其降解效率和選擇性。PROTAC分子的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)有待改善，由于其分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程可能與傳統(tǒng)小分子藥物不同，需要進(jìn)一步優(yōu)化以提高其生物利用度和穩(wěn)定性。長(zhǎng)期使用PROTAC藥物可能引發(fā)的潛在副作用和耐藥性問題也需要深入研究。未來(lái)，隨著對(duì)PROTAC技術(shù)作用機(jī)制的深入理解和相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，有望克服這些挑戰(zhàn)，推動(dòng)基于PROTAC技術(shù)的CDK抑制劑從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用。3.3.2其他靶向降解途徑除了PROTAC技術(shù)外，其他靶向降解途徑也在CDK抑制劑研發(fā)中受到關(guān)注，這些新興途徑為CDK的靶向降解提供了多樣化的策略，有望進(jìn)一步拓展CDK抑制劑的研發(fā)思路和應(yīng)用前景。分子膠（MolecularGlue）是一種能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的小分子化合物，其作用機(jī)制與PROTAC有相似之處，但也存在差異。分子膠可以特異性地結(jié)合到兩個(gè)蛋白質(zhì)之間，促使它們形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而改變蛋白質(zhì)的功能或命運(yùn)。在CDK降解方面，分子膠可以誘導(dǎo)CDK與E3泛素連接酶之間的相互作用，進(jìn)而使CDK被泛素化并通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。與PROTAC不同的是，分子膠通常是相對(duì)較小的分子，結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單，并且它所誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可能是自然界中原本不存在的，通過這種新穎的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK的降解。雖然目前關(guān)于分子膠在CDK降解方面的研究相對(duì)較少，但已有研究表明，分子膠在其他蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如具有較高的細(xì)胞穿透性和較低的免疫原性等。在未來(lái)的CDK抑制劑研發(fā)中，分子膠有望成為一種新的技術(shù)手段，為開發(fā)高效、低毒的CDK降解劑提供可能。自噬-溶酶體途徑（Autophagy-LysosomePathway）是細(xì)胞內(nèi)另一種重要的蛋白質(zhì)降解途徑，近年來(lái)也被探索用于CDK的靶向降解。自噬是細(xì)胞在應(yīng)對(duì)饑餓、應(yīng)激等條件下，通過形成自噬體將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等物質(zhì)包裹起來(lái)，然后與溶酶體融合，在溶酶體酶的作用下將其降解的過程。在CDK降解中，可以設(shè)計(jì)能夠激活自噬并引導(dǎo)自噬體特異性識(shí)別和包裹CDK的小分子化合物。例如，通過對(duì)CDK蛋白進(jìn)行修飾或設(shè)計(jì)與CDK特異性結(jié)合的配體，使其能夠被自噬相關(guān)蛋白識(shí)別并納入自噬體中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CDK的降解。與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相比，自噬-溶酶體途徑具有能夠降解較大的蛋白質(zhì)復(fù)合物和細(xì)胞器的優(yōu)勢(shì)，這對(duì)于一些難以被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解的CDK相關(guān)復(fù)合物可能具有重要意義。然而，利用自噬-溶酶體途徑降解CDK也面臨一些挑戰(zhàn)，如如何精確調(diào)控自噬的啟動(dòng)和靶向性，避免對(duì)正常細(xì)胞生理功能造成過多影響等。隨著對(duì)自噬機(jī)制研究的不斷深入，有望開發(fā)出基于自噬-溶酶體途徑的高效CDK降解策略?；诤怂岬慕到饧夹g(shù)，如小干擾RNA（siRNA）和短發(fā)夾RNA（shRNA），也為CDK的靶向降解提供了新的途徑。siRNA和shRNA可以通過RNA干擾（RNAi）機(jī)制特異性地結(jié)合并降解靶mRNA，從而抑制相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在CDK抑制劑研發(fā)中，可以設(shè)計(jì)針對(duì)CDKmRNA的siRNA或shRNA，通過轉(zhuǎn)染等方式將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使CDKmRNA被降解，進(jìn)而降低CDK蛋白的表達(dá)水平。這種方法具有高度的序列特異性，能夠精確地靶向特定的CDK亞型。但基于核酸的降解技術(shù)在臨床應(yīng)用中面臨著一些障礙，如核酸分子的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)易被核酸酶降解；細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低，如何將核酸分子有效地遞送至靶細(xì)胞是一個(gè)關(guān)鍵問題；此外，還可能引發(fā)免疫反應(yīng)等不良反應(yīng)。為了克服這些問題，研究人員正在不斷探索新的核酸遞送系統(tǒng)和修飾方法，如脂質(zhì)體、納米顆粒等遞送載體，以及對(duì)核酸分子進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性和降低免疫原性。隨著這些技術(shù)的不斷改進(jìn)，基于核酸的降解技術(shù)有望在CDK抑制劑研發(fā)中發(fā)揮更大的作用。四、研發(fā)案例分析4.1達(dá)爾西利：中國(guó)首個(gè)自研高選擇性CDK4/6抑制劑4.1.1研發(fā)背景與立項(xiàng)乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。在乳腺癌的眾多亞型中，激素受體（HR）陽(yáng)性、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）陰性的乳腺癌占據(jù)了相當(dāng)大的比例，約占所有乳腺癌病例的70%左右。這類乳腺癌患者的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)依賴于雌激素等激素信號(hào)通路，內(nèi)分泌治療是其主要的治療手段之一。然而，隨著治療的進(jìn)行，許多患者會(huì)出現(xiàn)內(nèi)分泌治療耐藥的情況，導(dǎo)致疾病進(jìn)展，此時(shí)患者的預(yù)后往往較差。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）在HR陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。CDK4/6與細(xì)胞周期蛋白D（CyclinD）結(jié)合形成復(fù)合物，通過磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，啟動(dòng)DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。在HR陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中，CDK4/6-CyclinD復(fù)合物常常過度激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞異常增殖。因此，抑制CDK4/6的活性成為克服內(nèi)分泌治療耐藥、治療HR陽(yáng)性乳腺癌的重要策略。2013年4月，全球首個(gè)CDK4/6抑制劑哌柏西利獲得FDA突破性療法認(rèn)定，并于2015年獲FDA批準(zhǔn)上市，這一突破改變了HR陽(yáng)性乳腺癌的治療格局，顯著提高了晚期患者的生存獲益。然而，直至2018年，CDK4/6抑制劑才被引入中國(guó)，晚國(guó)際三年?？紤]到中國(guó)人群的特點(diǎn)，如乳腺癌發(fā)病年齡相對(duì)較早，絕經(jīng)前患者比例較高等，以及中國(guó)乳腺癌患者對(duì)更適合國(guó)情的治療藥物的迫切需求。中國(guó)學(xué)者于2013年正式立項(xiàng)，開始專研CDK4/6抑制劑的藥物結(jié)構(gòu)優(yōu)化，致力于研發(fā)出一款高效、低毒、強(qiáng)活性且更適合中國(guó)患者的CDK4/6抑制劑，達(dá)爾西利（SHR6390）的研發(fā)項(xiàng)目應(yīng)運(yùn)而生。4.1.2結(jié)構(gòu)優(yōu)化與創(chuàng)新在達(dá)爾西利的研發(fā)過程中，結(jié)構(gòu)優(yōu)化與創(chuàng)新是其關(guān)鍵亮點(diǎn)。通過對(duì)已有CDK4/6抑制劑結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制的深入研究，研發(fā)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)既往同類CDK4/6抑制劑都含有對(duì)苯二胺結(jié)構(gòu)。在肝臟中，對(duì)苯二胺很容易被細(xì)胞色素CYP450氧化，并與肝臟中大量富集的谷胱甘肽發(fā)生不可逆的加成反應(yīng)，即谷胱甘肽捕獲效應(yīng)。這種加成物在肝臟中大量產(chǎn)生和蓄積可能引發(fā)一定程度的肝毒性，影響患者的治療安全性和耐受性。為了解決這一問題，達(dá)爾西利在項(xiàng)目立項(xiàng)之初，研發(fā)者就希望能夠降低藥物的肝毒性。在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中，通過經(jīng)典的電子等排體替換，創(chuàng)新性地引入哌啶基團(tuán)。哌啶基團(tuán)的引入有效地消除了谷胱甘肽捕獲風(fēng)險(xiǎn)，這成為了達(dá)爾西利最大的設(shè)計(jì)亮點(diǎn)之一。臨床相關(guān)研究充分驗(yàn)證了這一結(jié)構(gòu)優(yōu)化的優(yōu)勢(shì)，在相關(guān)研究中，達(dá)爾西利相關(guān)的3～4級(jí)AST升高的發(fā)生率僅為0.4%，3～4級(jí)ALT升高的發(fā)生率甚至為0。這表明達(dá)爾西利在肝臟安全性方面表現(xiàn)出色，大大降低了患者在治療過程中出現(xiàn)肝毒性的風(fēng)險(xiǎn)，提高了患者的用藥安全性。達(dá)爾西利還具有高體外活性和高CDK家族選擇性的特點(diǎn)。在對(duì)靶點(diǎn)CDK4/6的抑制作用上，達(dá)爾西利表現(xiàn)出強(qiáng)效抑制能力，能夠有效地阻斷CDK4/6-CyclinD復(fù)合物的活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。與此同時(shí)，達(dá)爾西利對(duì)CDK1、2、9的選擇性幾乎都達(dá)到1000倍以上。據(jù)報(bào)道，很多藥物分子的胃腸道毒性與CDK9的抑制密切相關(guān)，而達(dá)爾西利對(duì)CDK9幾乎無(wú)抑制作用。這使得達(dá)爾西利在預(yù)期胃腸道毒副反應(yīng)方面表現(xiàn)較弱，在臨床研究中也得到了驗(yàn)證，其胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率較低，患者的耐受性良好。這種高選擇性不僅提高了藥物的療效，還減少了因抑制其他CDK亞型而可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，為患者提供了更安全、有效的治療選擇。4.1.3臨床前與臨床試驗(yàn)結(jié)果在臨床前研究中，達(dá)爾西利在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。在大鼠和犬體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)表明，隨著藥物劑量的升高，達(dá)爾西利的血藥濃度隨之升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。與血漿的藥物濃度相比，達(dá)爾西利在腫瘤組織中的分布比例更高，這使得藥物能夠更有效地作用于腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮其抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。這些良好的藥代吸收特性為其后續(xù)的毒理評(píng)價(jià)與藥效模型評(píng)價(jià)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。達(dá)爾西利的臨床試驗(yàn)主要包括DAWNA-1和DAWNA-2研究，這兩項(xiàng)研究均取得了令人矚目的成果。DAWNA-1研究是一項(xiàng)在既往內(nèi)分泌治療進(jìn)展的HR+晚期乳腺癌患者中開展的Ⅲ期隨機(jī)對(duì)照研究，對(duì)比了達(dá)爾西利聯(lián)合氟維司群與單藥氟維司群的療效。該研究共納入39個(gè)中心的361例內(nèi)分泌治療失敗的HR+/HER2-晚期乳腺癌患者，其中達(dá)爾西利聯(lián)合氟維司群組241例，安慰劑聯(lián)合氟維司群組120例。研究允許接受過≤1線化療的患者入組，此類患者占總數(shù)的27%，絕經(jīng)前或圍絕經(jīng)期患者占44%，更符合中國(guó)乳腺癌患者特點(diǎn)。研究結(jié)果顯示，達(dá)爾西利組患者中位無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）延長(zhǎng)了8.5個(gè)月（15.7個(gè)月vs7.2個(gè)月，HR=0.42），在預(yù)設(shè)亞組中，PFS獲益均一致傾向于達(dá)爾西利組。至首次后續(xù)化療時(shí)間（TFST）、客觀緩解率（ORR）和臨床獲益率（CBR）等次要療效終點(diǎn)評(píng)估結(jié)果，也同樣體現(xiàn)出達(dá)爾西利的治療優(yōu)效性。該研究成果不僅入選2021年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO）的口頭報(bào)告環(huán)節(jié)，還在《自然?醫(yī)學(xué)》（NatureMedicine）刊發(fā)全文，成為首個(gè)登上該期刊的中國(guó)乳腺癌關(guān)鍵臨床研究，得到了國(guó)際醫(yī)學(xué)界的高度認(rèn)可。DAWNA-2研究是一項(xiàng)評(píng)估達(dá)爾西利聯(lián)合來(lái)曲唑/阿那曲唑一線治療HR+/HER2-晚期乳腺癌的療效與安全性的Ⅲ期臨床試驗(yàn)。研究共入組456例患者，按照2：1比例隨機(jī)分組接受達(dá)爾西利+來(lái)曲唑/阿那曲唑（302例）或安慰劑+來(lái)曲唑/阿那曲唑（153例）治療。研究結(jié)果顯示，達(dá)爾西利+來(lái)曲唑/阿那曲唑的中位PFS為30.6個(gè)月（95%CI：30.6-未達(dá)到[NR]），安慰劑+來(lái)曲唑/阿那曲唑?yàn)?8.2個(gè)月(95%CI：16.5-22.5)，聯(lián)合達(dá)爾西利治療延長(zhǎng)了12.4個(gè)月的PFS，降低疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)49%（HR=0.51；95%CI：0.38-0.69，P＜0.0001）。研究者評(píng)估的PFS與盲法獨(dú)立審查委員會(huì)（BIRC）評(píng)估的PFS相似（NRvs22.5個(gè)月，HR=0.50）。除了無(wú)病間期≤24個(gè)月的患者，達(dá)爾西利聯(lián)合治療在其余所有亞組獲得與總?cè)巳阂恢碌腜FS獲益趨勢(shì)。在占比約60%的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移患者中，達(dá)爾西利降低患者的疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)37%（HR=0.63；95%CI：0.43-0.90），非內(nèi)臟轉(zhuǎn)移亞組PFSHR為0.37（95%CI：0.23-0.61）。在不同絕經(jīng)狀態(tài)患者中，達(dá)爾西利聯(lián)合非甾體類芳香化酶抑制劑一線治療的PFS獲益也一致。在絕經(jīng)前/圍絕經(jīng)期患者中，達(dá)爾西利組和對(duì)照組的中位PFS分別為NR(95%CI：27.7-NR)和16.6個(gè)月(95%CI：12.9-27.7)，達(dá)爾西利組降低疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)47%（HR=0.53；95%CI：0.33-0.85；P=0.0039）。在絕經(jīng)后患者中，達(dá)爾西利組和對(duì)照組的中位PFS分別為30.6個(gè)月(95%CI：24.9-NR)和19.4個(gè)月(95%CI：16.6-24.6)，達(dá)爾西利組降低疾病進(jìn)展或死亡風(fēng)險(xiǎn)48%（HR=0.52；95%CI：0.36-0.75；P=0.0002）。研究者評(píng)估的達(dá)爾西利組與對(duì)照組的ORR分別為57%(95%CI：52%-63%)和48%(95%CI：40%-56%)(P=0.023)。達(dá)爾西利組2例（＜1%）患者達(dá)到完全緩解（CR），57%的患者達(dá)到部分緩解（PR），29%的患者達(dá)到疾病穩(wěn)定(SD)。在對(duì)照組沒有CR患者，48%的患者達(dá)到PR，39%達(dá)到SD。兩組的CBR分別為87%(95%CI：83%-90%)和80%(95%CI：73%-86%)，中位DoR分別為NR和15.0個(gè)月。該研究結(jié)果于2023年5月在線發(fā)表在《柳葉刀?腫瘤學(xué)》（TheLancetOncology，影響因子51.1），為達(dá)爾西利聯(lián)合來(lái)曲唑/阿那曲唑作為HR+/HER2-晚期乳腺癌患者一線治療提供了強(qiáng)有力的循證證據(jù)。在安全性方面，達(dá)爾西利治療的不良反應(yīng)主要為血液學(xué)不良反應(yīng)，以中性粒細(xì)胞減少為主，但未發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞減少性發(fā)熱，也無(wú)患者因中性粒細(xì)胞減少停止治療。通過劑量調(diào)整等措施，中性粒細(xì)胞減少等血液學(xué)不良反應(yīng)可控。治療的非血液學(xué)不良反應(yīng)整體輕微，3-4級(jí)肝臟毒性發(fā)生率較低，且未觀察到腹瀉發(fā)生。達(dá)爾西利的不良反應(yīng)類型單一，易處理，并且與CDK4/6抑制劑的已知不良反應(yīng)一致。其可感知副作用較小，有利于提高患者的用藥依從性，保障治療的順利進(jìn)行。4.2JSH-150：新型高選擇性CDK9激酶抑制劑4.2.1針對(duì)CDK9靶點(diǎn)的研究意義CDK9作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族的重要成員，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮著核心作用，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，使得CDK9成為極具潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。在正常細(xì)胞生理過程中，CDK9主要通過與細(xì)胞周期蛋白T（CyclinT）結(jié)合形成正性轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）復(fù)合物，在基因轉(zhuǎn)錄延伸階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。P-TEFb復(fù)合物能夠磷酸化RNA聚合酶II（RNAPII）的C末端結(jié)構(gòu)域（CTD）中的絲氨酸2位點(diǎn)（Ser2），以及負(fù)性轉(zhuǎn)錄延伸因子（NELF）和DRB敏感性誘導(dǎo)因子（DSIF）。這一磷酸化過程能夠解除轉(zhuǎn)錄延伸的阻滯，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的順利進(jìn)行，確保細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的正常合成，維持細(xì)胞的正常生理功能。例如，在細(xì)胞分化過程中，CDK9-CyclinT復(fù)合物能夠調(diào)控一系列與細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄延伸，如在神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過程中，CDK9參與調(diào)控神經(jīng)特異性基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的成熟和功能的完善。然而，在腫瘤細(xì)胞中，CDK9的異常激活會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄程序的紊亂，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，在多種腫瘤類型中，如白血病、肺癌、乳腺癌等，CDK9的表達(dá)水平明顯升高，且其活性異常增強(qiáng)。在白血病細(xì)胞中，CDK9的過度激活會(huì)導(dǎo)致抗凋亡基因和增殖相關(guān)基因的高表達(dá)。例如，抗凋亡蛋白Mcl-1是CDK9的重要下游靶基因之一，CDK9能夠促進(jìn)Mcl-1基因的轉(zhuǎn)錄延伸，使其表達(dá)水平顯著升高。Mcl-1蛋白能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使得白血病細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)增殖。在肺癌細(xì)胞中，CDK9的異常激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。CDK9通過調(diào)控一些與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍組織的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。鑒于CDK9在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，研發(fā)針對(duì)CDK9的抑制劑具有重要的臨床意義。CDK9抑制劑能夠特異性地抑制CDK9的活性，阻斷其對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。與傳統(tǒng)的化療藥物相比，CDK9抑制劑具有更高的靶向性，能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，降低治療過程中的不良反應(yīng)。目前，雖然已有一些CDK9抑制劑處于臨床試驗(yàn)階段，但仍存在選擇性不高、副作用較大等問題。因此，研發(fā)新型、高選擇性的CDK9抑制劑，對(duì)于滿足腫瘤患者的臨床需求，提高腫瘤治療的效果和安全性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。4.2.2設(shè)計(jì)理念與研發(fā)過程JSH-150的設(shè)計(jì)理念基于對(duì)CDK9蛋白結(jié)構(gòu)和功能的深入理解，旨在開發(fā)一種能夠特異性結(jié)合CDK9的ATP結(jié)合口袋，高效抑制其激酶活性，同時(shí)對(duì)其他CDK家族成員具有高選擇性的小分子抑制劑。在研發(fā)過程中，首先利用X射線晶體學(xué)和核磁共振等技術(shù)，對(duì)CDK9蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了精確解析，特別是對(duì)其ATP結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了詳細(xì)分析。研究發(fā)現(xiàn)，CDK9的ATP結(jié)合口袋具有一些獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如口袋的大小、形狀以及關(guān)鍵氨基酸殘基的分布等，這些特征為設(shè)計(jì)高選擇性的抑制劑提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。與其他CDK家族成員相比，CDK9的ATP結(jié)合口袋在某些關(guān)鍵位置的氨基酸殘基存在差異，如CDK9的ATP結(jié)合口袋中的Gly112殘基，在CDK2中對(duì)應(yīng)的是Lys89殘基，這種差異導(dǎo)致了兩者ATP結(jié)合口袋的空間結(jié)構(gòu)和靜電性質(zhì)有所不同?；谶@些結(jié)構(gòu)信息，采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）技術(shù)，運(yùn)用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，在虛擬化合物庫(kù)中進(jìn)行篩選。分子對(duì)接通過模擬小分子化合物與CDK9的ATP結(jié)合口袋的相互作用，預(yù)測(cè)化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合親和力和結(jié)合模式。在分子對(duì)接過程中，將大量的小分子化合物逐一與CDK9的ATP結(jié)合口袋進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算每個(gè)化合物與口袋之間的結(jié)合自由能、氫鍵相互作用、疏水相互作用等參數(shù)，篩選出具有較高結(jié)合親和力和合理結(jié)合模式的化合物作為先導(dǎo)化合物。分子動(dòng)力學(xué)模擬則進(jìn)一步對(duì)先導(dǎo)化合物與CDK9的復(fù)合物進(jìn)行動(dòng)態(tài)模擬，研究復(fù)合物在不同時(shí)間尺度下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和相互作用的動(dòng)態(tài)變化，優(yōu)化化合物的結(jié)構(gòu)，提高其與CDK9的結(jié)合穩(wěn)定性和選擇性。在篩選出先導(dǎo)化合物后，通過化學(xué)合成技術(shù)對(duì)其進(jìn)行合成和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。根據(jù)先導(dǎo)化合物與CDK9的結(jié)合模式和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和改造，如引入不同的取代基、改變分子的空間構(gòu)型等，以提高化合物的活性和選擇性。在結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程中，通過一系列的生物活性測(cè)試，如激酶活性測(cè)定、細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析等，對(duì)合成的化合物進(jìn)行活性評(píng)估和篩選。激酶活性測(cè)定采用放射性標(biāo)記的ATP或熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等方法，測(cè)定化合物對(duì)CDK9激酶活性的抑制作用。細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)則通過MTT法、CCK-8法等，檢測(cè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果。細(xì)胞周期分析利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞周期分布的影響。通過這些實(shí)驗(yàn)，篩選出活性高、選擇性好的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究和優(yōu)化。經(jīng)過多輪的篩選和優(yōu)化，最終得到了JSH-150這一新型高選擇性CDK9激酶抑制劑。在后續(xù)的研究中，對(duì)JSH-150的理化性質(zhì)、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及安全性等方面進(jìn)行了全面的評(píng)估，為其進(jìn)一步的臨床前研究和臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。4.2.3生物學(xué)活性與抗腫瘤效果JSH-150在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均展現(xiàn)出了良好的生物學(xué)活性和顯著的抗腫瘤效果。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過激酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)JSH-150能夠高效地抑制CDK9的激酶活性。在以放射性標(biāo)記的ATP為底物的激酶活性測(cè)定中，JSH-150對(duì)CDK9的半抑制濃度（IC50）值低至納摩爾級(jí)別，表明其對(duì)CDK9具有很強(qiáng)的抑制能力。進(jìn)一步的研究表明，JSH-150能夠特異性地結(jié)合CDK9的ATP結(jié)合口袋，通過與口袋中的關(guān)鍵氨基酸殘基形成氫鍵和疏水相互作用，穩(wěn)定地結(jié)合在靶點(diǎn)上，從而阻斷ATP與CDK9的結(jié)合，抑制其激酶活性。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，JSH-150對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的增殖具有顯著的抑制作用。以白血病細(xì)胞系K562和肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為例，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，隨著JSH-150濃度的增加，K562和A549細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。在IC50濃度下處理細(xì)胞一定時(shí)間后，細(xì)胞增殖抑制率分別達(dá)到了[X]%和[X]%。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)JSH-150能夠使腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期，減少S期和G2/M期細(xì)胞的比例。這表明JSH-150通過抑制CDK9的活性，阻斷了細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。JSH-150還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，在JSH-150處理后，K562和A549細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，JSH-150誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制與下調(diào)抗凋亡蛋白Mcl-1的表達(dá)密切相關(guān)。CDK9的抑制使得Mcl-1基因的轉(zhuǎn)錄延伸受阻，導(dǎo)致Mcl-1蛋白表達(dá)水平降低，從而解除了其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，建立了人源腫瘤細(xì)胞異種移植（PDX）小鼠模型，以評(píng)估JSH-150的抗腫瘤效果。將K562細(xì)胞接種到裸鼠皮下，待腫瘤體積生長(zhǎng)至一定大小時(shí)，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組給予JSH-150灌胃處理，對(duì)照組給予生理鹽水處理。定期測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照組相比，腫瘤體積在給藥后[X]天顯著減小。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，取腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織中出現(xiàn)了明顯的壞死區(qū)域，細(xì)胞凋亡增加，增殖活性降低。JSH-150在體內(nèi)還具有較好的安全性。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，且未觀察到明顯的藥物相關(guān)不良反應(yīng)，如腹瀉、脫毛、精神萎靡等。通過對(duì)小鼠的血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)JSH-150對(duì)小鼠的血液系統(tǒng)和肝腎功能無(wú)明顯影響。這表明JSH-150在有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，具有良好的安全性，為其進(jìn)一步的臨床研究提供了有力的支持。五、研發(fā)挑戰(zhàn)與應(yīng)對(duì)策略5.1選擇性難題CDK家族成員眾多，它們?cè)诩っ附Y(jié)構(gòu)域的序列和整體三維結(jié)構(gòu)上具有高度的相似性，這給研發(fā)具有高選擇性的CDK抑制劑帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。在激酶結(jié)構(gòu)域中，CDK家族成員的氨基酸序列同源性較高，例如，CDK4和CDK6的激酶結(jié)構(gòu)域氨基酸序列同源性超過70%，這種高度的序列相似性使得它們的ATP結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)極為相近。ATP結(jié)合口袋是CDK發(fā)揮激酶活性的關(guān)鍵區(qū)域，也是大多數(shù)CDK抑制劑的作用靶點(diǎn)。在CDK4和CDK6的ATP結(jié)合口袋中，與ATP結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基幾乎完全相同，這使得傳統(tǒng)的基于ATP結(jié)合口袋設(shè)計(jì)的抑制劑很難區(qū)分這兩個(gè)靶點(diǎn)，容易導(dǎo)致對(duì)CDK4和CDK6的非選擇性抑制。除了CDK4和CDK6，其他CDK家族成員之間也存在類似的結(jié)構(gòu)相似性問題。CDK1、CDK2、CDK7、CDK9等成員的激酶結(jié)構(gòu)域同樣具有較高的同源性，它們的ATP結(jié)合口袋在大小、形狀以及關(guān)鍵氨基酸殘基的分布上存在諸多相似之處。這種結(jié)構(gòu)相似性使得研發(fā)能夠特異性作用于某一特定CDK，而對(duì)其他CDK亞型影響較小的抑制劑變得異常困難。如果抑制劑的選擇性不足，在抑制目標(biāo)CDK的同時(shí)，也可能會(huì)抑制其他CDK的活性，從而干擾正常細(xì)胞的生理功能，引發(fā)一系列副作用。在一些臨床試驗(yàn)中，非選擇性的CDK抑制劑可能會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、肝臟毒性等不良反應(yīng)，這不僅影響了患者的治療體驗(yàn)，還限制了藥物的使用劑量和治療周期。為了解決CDK抑制劑的選擇性難題，研究人員采取了多種策略。在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)方面，通過高分辨率的X射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）等技術(shù)，對(duì)不同CDK家族成員的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確解析，深入研究它們ATP結(jié)合口袋的細(xì)微差異。利用這些結(jié)構(gòu)信息，運(yùn)用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（CADD）方法，在虛擬化合物庫(kù)中篩選能夠與目標(biāo)CDK的ATP結(jié)合口袋特異性結(jié)合的小分子化合物。通過優(yōu)化化合物的結(jié)構(gòu)，使其能夠更好地契合目標(biāo)CDK的ATP結(jié)合口袋，增強(qiáng)與關(guān)鍵氨基酸殘基的相互作用，從而提高抑制劑的選擇性。變構(gòu)抑制劑的研發(fā)也是解決選擇性難題的重要策略之一。變構(gòu)位點(diǎn)通常位于CDK蛋白的非活性中心區(qū)域，與ATP結(jié)合口袋相距較遠(yuǎn)，其結(jié)構(gòu)和氨基酸組成在不同的CDK家族成員之間存在較大差異。這使得變構(gòu)抑制劑能夠特異性地作用于目標(biāo)CDK，減少對(duì)其他CDK亞型的干擾。通過實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法，尋找CDK蛋白上的變構(gòu)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)能夠與變構(gòu)位點(diǎn)特異性結(jié)合的小分子化合物。實(shí)驗(yàn)方法包括X射線晶體學(xué)、核磁共