wastewaterbasedonhigh-throughputsequencingtechnology深圳市標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)發(fā)布I 3 3 3 3 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6 6 8 9 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。心（武漢海關(guān)口岸門診部）、中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心、深圳天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公東來(lái)、杜琛、徐曉慶、龔睿、王藝凱、顏妙麗、蘇鳳俠、楊自飛1基于高通量測(cè)序技術(shù)的污水來(lái)源新型冠狀病毒變異監(jiān)測(cè)通用技術(shù)要求——以桑格（Sanger）測(cè)序?yàn)橹饕夹g(shù)原理的第一代基因測(cè)序領(lǐng)域；——宏基因組測(cè)序、探針捕獲靶向測(cè)序。GB/T30989—2014高通量基因測(cè)序WS/T799—2022污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)新型冠狀病毒severeacuterespirato2），對(duì)核酸分子不同堿基類型的測(cè)定，即測(cè)定組成核酸分子的腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)或者尿嘧啶(U)等堿基的排列順序。作為測(cè)序模板的核酸片段，具有特定的大小范圍，通常包含：接頭和/或用于測(cè)序引物結(jié)合的特定堿基識(shí)別質(zhì)量qualityofbasecal評(píng)價(jià)堿基準(zhǔn)確識(shí)別的概率，簡(jiǎn)稱為Q，通常以數(shù)值定義，定義Q=-10log10(P)，其中P為堿基識(shí)別的注2：堿基識(shí)別質(zhì)量值越高，錯(cuò)誤率越低。如Q20指堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為99%，或錯(cuò)誤3單核苷酸位點(diǎn)突變singlenucle株系豐度abundanceofva指在特定樣本中，某個(gè)新冠病毒變異株在所有變異株中所占的4縮略語(yǔ)CT：循環(huán)閾值（CyclethresDNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicaciMb：兆/百萬(wàn)條reads（Megabase）RNA：核糖核酸（RibonucleicRT-qPCR：逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（ReverseTranscriptionQuantitativePolymeraseChSNV：?jiǎn)魏塑账嵛稽c(diǎn)突變（SinglenucleotideSARS-CoV-2：新型冠狀病毒（Severeacuterespiratorysyndromecoronavi基于高通量測(cè)序技術(shù)的污水來(lái)源新型冠狀病毒變異監(jiān)測(cè)采用多重PCR擴(kuò)增子測(cè)序的方法對(duì)污水樣本中的新型冠狀病毒RNA進(jìn)行測(cè)序，數(shù)據(jù)分析獲取污水中新冠病毒變異株株系豐度，主要通過(guò)以下步驟實(shí)d)數(shù)據(jù)分析：對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、比對(duì)、變異株檢測(cè)，獲得污水中新冠病毒變異株株系4九版）的通知》中的附件12《新冠病毒標(biāo)本采集和試驗(yàn)操作中需要滿足的實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求應(yīng)符合附錄A的規(guī)定；試驗(yàn)操作中需要的試驗(yàn)試劑清單、試劑材料清單、儀器與設(shè)備清單應(yīng)符合附錄B樣。在疫情早期，可通過(guò)在社區(qū)布點(diǎn)進(jìn)行3小時(shí)混合樣采集，有利于實(shí)現(xiàn)早期預(yù)警和溯源；在疾病流行樣本采集后應(yīng)在現(xiàn)場(chǎng)使用75%酒精對(duì)采樣瓶外表面進(jìn)行消毒，然后將采樣瓶裝入密封采樣袋中，對(duì)密封采樣袋外表面再次進(jìn)行消毒，并將樣本放于0℃~4℃冷藏條件下，2小時(shí)內(nèi)送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。進(jìn)行全天24小時(shí)的連續(xù)采樣，每1小時(shí)采集一次，共采集24次以制備混合樣本。根據(jù)檢測(cè)需要設(shè)定采集結(jié)束后，將所有樣本混合均勻，并分裝至250mL的樣本容器中，隨后送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)1至2次。當(dāng)疫情進(jìn)入高峰期時(shí)，建議增加采樣頻次至每周至少3次，以便更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)病毒的傳播和變5樣本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)保存于0℃~4℃環(huán)境中，并在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行富集濃縮處理。富集前應(yīng)將樣本括聚乙二醇沉淀法、鋁鹽混凝沉淀法和離心超濾法。若參照標(biāo)準(zhǔn)有更新，以更新的標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)。6.5污水樣本的核酸提取及新冠病毒核采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)。選擇適用于污水樣本新冠病毒核酸檢測(cè)的）；6需適當(dāng)提高測(cè)序數(shù)據(jù)量。根據(jù)不同的數(shù)據(jù)分析和時(shí)效性需求，選擇不同的測(cè)序策CVR——測(cè)序覆蓋率；CVB——覆蓋到的基因組序列堿基數(shù)；GB——基因組全部堿基數(shù)。MBDP——測(cè)序平均深度；MB——總比對(duì)堿基數(shù)；CVB——覆蓋到的基因組序列堿基數(shù)。6.8.2獲得比對(duì)文件基礎(chǔ)上，通過(guò)軟件或工具將比對(duì)文件中的SN差回歸（Depth-weightedLeastAbsoluteDeviati序列數(shù)據(jù)中的多個(gè)SARS-CoV-2株系豐度占比；最終通過(guò)7a)清晰標(biāo)記添加的標(biāo)簽接頭，防止標(biāo)簽之間a)根據(jù)測(cè)序和數(shù)據(jù)需求選擇合適的測(cè)序策略，如SE100+1b)根據(jù)數(shù)據(jù)分析需求選擇合適的數(shù)據(jù)量。若以10×測(cè)序深度的60%覆蓋度為標(biāo)準(zhǔn)納入監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，通常1Mbreads/樣本的數(shù)據(jù)量即可滿足基本的監(jiān)測(cè)需求，5Mbreads/樣本的數(shù)據(jù)量可獲得更佳的測(cè)序結(jié)果；當(dāng)污水樣本中富集的新冠病毒濃度均較低時(shí)（CT值>32），5Mbr的數(shù)據(jù)量可滿足基本的監(jiān)測(cè)需求。綜上，推薦每個(gè)污水樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量為5Mbrea）；位點(diǎn)相同時(shí)，無(wú)法準(zhǔn)確判定株系及其豐度，應(yīng)將對(duì)應(yīng)的株系以“|”間隔合并輸出8實(shí)驗(yàn)室儀器和設(shè)備要求應(yīng)符合GB19489-2008的規(guī)定。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)符合《新型冠狀病毒實(shí)驗(yàn)室生物安護(hù)；感染性材料或活病毒在采用可靠方法滅活后進(jìn)行的核酸檢測(cè)操作應(yīng)在BSL-2進(jìn)行。新冠狀病毒RNA反轉(zhuǎn)錄后的相關(guān)操作可在生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室（BSL-1）進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)不同工作內(nèi)容劃分獨(dú)立區(qū)A.2.1試劑儲(chǔ)存區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)離心機(jī)、試驗(yàn)臺(tái)、渦旋振蕩器、微量加樣器等。為防止污染，該區(qū)宜保持A.2.2樣本與文庫(kù)制備區(qū)標(biāo)本的分裝以及核酸提取應(yīng)在獨(dú)立的生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，提取后的核酸可以轉(zhuǎn)運(yùn)A.2.3核酸擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)和產(chǎn)物分析。該區(qū)應(yīng)配備PCR擴(kuò)增儀。為防止擴(kuò)增產(chǎn)物污染環(huán)境，該區(qū)宜保持負(fù)A.2.4高通量測(cè)序區(qū)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、報(bào)告審核及發(fā)放。該區(qū)應(yīng)配備高通9a)病毒核酸提取試劑盒，用于釋放和獲得各類樣本中的核酸并進(jìn)行純化；b)新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒（RT-qPCR法），用于樣本中新冠病毒的定量檢測(cè)；d)新冠病毒全基因組多重PCR擴(kuò)增試劑，用于富集新型冠狀病毒全基因組，試劑盒內(nèi)至少e)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建試劑，用于核酸樣品的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建，試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含：接頭、標(biāo)簽、純g)測(cè)序試劑盒，用于對(duì)測(cè)序文庫(kù)的上機(jī)測(cè)序，試劑盒內(nèi)至少應(yīng)包含：測(cè)序引物、高效測(cè)序反應(yīng)d)無(wú)菌移液器吸頭：2μL、10μL、100μL、200μ注：其他材料參照所使用的試劑盒。污水中新冠病毒變異株不同株系豐度進(jìn)行分析。Freyja軟件的開發(fā)者使用matUtils包從UShER系統(tǒng)發(fā)育同變異株定義突變的數(shù)據(jù)庫(kù)，“Barcode”矩陣文件--“usher_barcodes.其中ai,j表示變異株i在j處的突變。Freyja將測(cè)序數(shù)據(jù)與新冠病毒參考序列比對(duì)后獲得的比對(duì)文件作為輸入文件，與新冠病毒株系定義突變數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，估計(jì)SNV的突變頻率和深度；通過(guò)深度加權(quán)最小絕對(duì)偏差回歸分析混合樣本短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)中的多個(gè)新冠病毒株系豐度分布結(jié)果（譜系反卷積，建議用戶參照Github上Freyja軟件官方提供的教程，借助Conda環(huán)境管理工具來(lái)完Conda是一個(gè)開源的軟件包管理系統(tǒng)和環(huán)境管理系統(tǒng)，用于安裝多個(gè)版本的軟件包及其依賴關(guān)系，適用于Linux，OSX和Windows。實(shí)際使用時(shí)可應(yīng)用Miniconda，其為conda輕量級(jí)的發(fā)行版。可通過(guò)miniconda官方網(wǎng)站或通過(guò)國(guó)內(nèi)鏡像源下載安裝Miniconda最新版本，并根據(jù)自己需求添加channel建議用戶訪問(wèn)Freyja軟件的使用指南網(wǎng)址，在確認(rèn)已成功安裝Conda環(huán)境管理工具的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格根據(jù)Freyja網(wǎng)站指引使用Freyja軟件，輸入測(cè)序數(shù)據(jù)與新冠病毒參考序列的比對(duì)文件，生成SNV表格文件