第1節(jié)植物細胞工程第1課時植物細胞工程的基本技術[學習目標]1.概述植物組織培養(yǎng)的原理和過程。2.概述植物體細胞雜交的原理和過程。一、細胞工程概念及植物組織培養(yǎng)技術1．細胞工程(1)概念：應用細胞生物學、分子生物學和發(fā)育生物學等多學科的原理和方法，通過細胞器、細胞或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細胞、組織、器官、個體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。(2)分類：依據(jù)操作對象分為植物細胞工程和動物細胞工程。2．細胞的全能性(1)概念：細胞經(jīng)分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細胞的潛能。(2)在生物的生長發(fā)育過程中，并不是所有細胞都表現(xiàn)出全能性的原因：在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性地表達。3．植物組織培養(yǎng)：將離體的植物器官、組織或細胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導其形成完整植株的技術。這些離體培養(yǎng)的植物器官、組織或細胞被稱為外植體。4．菊花的組織培養(yǎng)(1)原理①理論基礎：植物細胞的全能性。②相關概念愈傷組織：細胞排列疏松且無規(guī)則、高度液泡化、不定形的薄壁組織團塊。脫分化：已經(jīng)分化的細胞，經(jīng)過誘導，失去其特有的結構和功能而轉變成未分化細胞的過程。再分化：愈傷組織重新分化成芽、根等器官的過程。③激素的作用：植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素，它們的濃度、比例等都會影響植物細胞的發(fā)育方向。(2)步驟判斷正誤(1)植物體的任何細胞都具有全能性，也都能表現(xiàn)出全能性()(2)在植物組織培養(yǎng)時，對外植體要進行滅菌處理()(3)若用菊花莖切段作為外植體，應將其形態(tài)學上端插入誘導愈傷組織的培養(yǎng)基中()(4)誘導生芽的培養(yǎng)基和誘導生根的培養(yǎng)基完全一樣()答案(1)×(2)×(3)×(4)×提示(1)植物細胞一般具有全能性，但并不是具有全能性的細胞都能表達全能性，細胞全能性的表達需要一系列條件。(2)在植物組織培養(yǎng)時，對外植體要進行消毒處理。(3)若用菊花莖切段作為外植體，應將其形態(tài)學下端插入誘導愈傷組織的培養(yǎng)基中。(4)生長素與細胞分裂素的比值高時，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低時，有利于芽的分化、抑制根的形成，因此誘導生芽的培養(yǎng)基和誘導生根的培養(yǎng)基不完全相同。任務一：植物組織培養(yǎng)的過程和條件1．請結合圖中植物組織的變化，思考回答下列問題：(1)概括出植物組織培養(yǎng)的技術流程圖。提示外植體eq\o(→,\s\up7(脫分化))愈傷組織eq\o(→,\s\up7(再分化))芽、根等→試管苗eq\o(→,\s\up7(馴化移栽))完整植株。(2)圖中的愈傷組織細胞與葉肉細胞相比，不含有的細胞器是葉綠體，原因是外植體經(jīng)過誘導后，失去其特有的結構和功能而轉變成未分化的細胞。2．請結合菊花組織培養(yǎng)的實驗步驟，思考回答下列問題：(1)為什么要強調(diào)所用器械的滅菌和實驗人員的無菌操作？提示避免雜菌與培養(yǎng)物競爭營養(yǎng)，且有些雜菌會危害培養(yǎng)物的生長。(2)菊花組織培養(yǎng)過程中，誘導外植體脫分化形成愈傷組織的培養(yǎng)基，其成分中包含(填“包含”或“不包含”)蔗糖等有機物，因為此時外植體不能進行光合作用制造有機物，需要依賴環(huán)境中的有機物才能生存。(3)在一定的激素和營養(yǎng)等條件的誘導下，已經(jīng)分化的細胞可以經(jīng)過脫分化轉變成愈傷組織。植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素。(4)在植物組織培養(yǎng)的過程中，光照條件的控制：脫分化過程中一般不需要光照，再分化過程中需要給予適當時間和強度的光照。1．植物組織培養(yǎng)的條件：(1)離體；(2)無菌；(3)培養(yǎng)基(種類齊全、比例合適的營養(yǎng)物質及一定比例的植物激素)；(4)適宜的培養(yǎng)條件(溫度、光照等)。2．生長素和細胞分裂素用量的比例對植物細胞發(fā)育方向的影響生長素用量與細胞分裂素用量的比值結果比值高有利于根的分化，抑制芽的形成比值低有利于芽的分化，抑制根的形成比值適中促進愈傷組織的形成[拓展閱讀]愈傷組織的細胞排列疏松且無規(guī)則，是一種高度液泡化的無定形狀態(tài)的細胞。愈傷組織形成以后，如果在原來的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，就會由于培養(yǎng)基中養(yǎng)分不足或產(chǎn)生有毒代謝物，導致愈傷組織生長停止，甚至老化變黑乃至死亡。如果要愈傷組織繼續(xù)生長增殖，必須定期地將它們分成小塊，接種到新鮮的培養(yǎng)基上，這樣愈傷組織就可以長期保持旺盛的生長。愈傷組織的再分化主要有兩種方式：一種是不定芽方式，就是在某些條件下，愈傷組織的細胞發(fā)生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽和根；另一種是胚狀體方式，就是由愈傷組織誘導分化出的具有胚芽、胚根、胚軸的類似胚的結構。能夠產(chǎn)生胚狀體的愈傷組織常見于胡蘿卜、蘆筍、玉米和小麥等植物。1．(2023·南通高二期中)下列關于菊花組織培養(yǎng)的敘述，正確的是()A．用自然生長的莖進行組織培養(yǎng)需要用適宜濃度的乙醇和次氯酸鈉的混合液消毒B．培養(yǎng)瓶用專用封口膜封口可防止外界雜菌侵入并阻止瓶內(nèi)外的氣體交換C．再生植株需要去除根部殘留的培養(yǎng)基進行鍛煉后才能移種大田D．試管苗鍛煉時采用蛭石作為栽培基質的原因是蛭石帶菌量低且營養(yǎng)豐富答案C解析自然生長莖段的消毒屬于外植體消毒，先用體積分數(shù)為70%的酒精消毒，立即用無菌水清洗，再用質量分數(shù)為5%的次氯酸鈉溶液處理，立即用無菌水清洗，A錯誤；培養(yǎng)瓶用專用封口膜封口的目的是防止雜菌污染，并不影響氣體交換，B錯誤；試管苗生存能力較弱，需要進行鍛煉，采用蛭石作為栽培基質的原因是蛭石保水透氣，蛭石不含營養(yǎng)，D錯誤。2．如圖是植物組織培養(yǎng)過程示意圖，下列相關說法正確的是()A．上述植物組織培養(yǎng)過程依據(jù)的生物學原理是植物細胞具有全能性B．需要對外植體進行嚴格的滅菌處理，以防止雜菌污染C．外植體若是月季的花藥，則圖中的①過程需要光照D．外植體若是菊花的根尖組織，因細胞中沒有葉綠體，故培養(yǎng)成的新植株葉片無色答案A解析外植體一般只消毒，不進行滅菌處理，以保持外植體的活性，B錯誤；①是脫分化過程，月季花藥的脫分化過程不需要光照且應避光培養(yǎng)，當愈傷組織再分化形成芽和葉時才需要適當時間和強度的光照，C錯誤；菊花根尖組織中含有控制葉綠體形成的基因，在培養(yǎng)過程中，基因的選擇性表達會使培養(yǎng)成的新植株葉片呈綠色，D錯誤。二、植物體細胞雜交技術1．概念：將不同來源的植物體細胞，在一定條件下融合成雜種細胞，并把雜種細胞培育成新植物體的技術。2．過程(1)去壁：用纖維素酶和果膠酶去除植物細胞壁，獲得原生質體。(2)人工誘導原生質體融合的方法①物理法：電融合法、離心法等。②化學法：聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。3．原理：原生質體融合的過程利用了細胞膜的流動性，雜種細胞發(fā)育成雜種植株利用了植物細胞的全能性。4．意義：打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種，培育植物新品種。判斷正誤(1)植物體細胞雜交技術的目的是獲得雜種細胞()(2)植物體細胞雜交利用了植物組織培養(yǎng)技術()(3)植物原生質體融合的原理是植物細胞的全能性()(4)利用物理法或化學法可以直接誘導兩個植物細胞融合()答案(1)×(2)√(3)×(4)×提示(1)植物體細胞雜交技術的目的是獲得雜種植株。(3)植物原生質體融合的原理是細胞膜具有流動性。(4)兩個植物細胞需要先用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁，獲得具有活力的原生質體，再用物理法或化學法誘導原生質體融合。任務二：植物體細胞雜交技術1．A種原生質體與B種原生質體融合后，有3種類型(只考慮兩兩融合)，分別是AA、BB、AB，其中我們需要的是AB，所以原生質體融合后，我們要對融合后的原生質體進行篩選。2．若A細胞具有2x條染色體，2個染色體組，基因型為Aabb。B細胞含有2y條染色體，2個染色體組，基因型為ccDd，則通過植物體細胞雜交技術獲得的新植株的染色體條數(shù)：2x＋2y；染色體組數(shù)：4個；基因型：AabbccDd；屬于可遺傳變異類型中的染色體數(shù)目變異。3．“番茄—馬鈴薯”雜種植株沒有如科學家所想象的那樣，地上結番茄，地下結馬鈴薯，主要原因是生物體內(nèi)基因的表達不是孤立的，它們之間是相互調(diào)控、相互影響的，所以“番茄—馬鈴薯”雜種植株的細胞中雖然具備兩個物種的遺傳物質，但是這些遺傳物質的表達相互干擾，它們不能再像馬鈴薯或番茄植株中的遺傳物質一樣有序表達。特別提醒(1)原生質體融合成功的標志是再生出細胞壁。植物體細胞雜交完成的標志是培育出雜種植株。(2)植物體細胞雜交的培養(yǎng)基中要添加蔗糖溶液且濃度略大于原生質體內(nèi)的濃度，這樣不僅能為原生質體提供營養(yǎng)，而且還能維持一定的滲透壓，使原生質體保持正常的形態(tài)。3．(2023·廣東，12)人參皂苷是人參的主要活性成分。科研人員分別誘導人參根與胡蘿卜根產(chǎn)生愈傷組織并進行細胞融合，以提高人參皂苷的產(chǎn)率。下列敘述錯誤的是()A．細胞融合前應去除細胞壁B．高Ca2＋—高pH溶液可促進細胞融合C．融合的細胞即為雜交細胞D．雜交細胞可能具有生長快速的優(yōu)勢答案C解析在細胞融合前，必須先用纖維素酶和果膠酶去除細胞壁，再誘導原生質體融合，A正確；人工誘導植物原生質體融合可用高Ca2＋—高pH融合法，用高Ca2＋—高pH溶液可促進細胞融合，B正確；若只考慮細胞兩兩融合，融合的細胞中有人參根－人參根細胞、人參根－胡蘿卜根細胞、胡蘿卜根－胡蘿卜根細胞，只有人參根－胡蘿卜根細胞才是雜交細胞，C錯誤；雜交細胞含兩種細胞的遺傳物質，可能具有生長快速的優(yōu)勢，D正確。4．(多選)如圖為植物體細胞雜交技術的流程圖，其中甲和乙分別表示兩種二倍體植物細胞，所含有的染色體組分別是AA和BB。據(jù)圖分析，下列敘述正確的是()A．經(jīng)過程①獲得的a、b稱為原生質體，過程②利用了細胞膜的流動性B．c細胞只有AABB這一種類型C．過程③和④分別是脫分化和再分化D．獲得的植株d，因為在減數(shù)分裂時同源染色體能正常配對，所以理論上是可育的答案AD解析若只考慮兩兩融合，則融合的細胞有三種類型：AAAA、BBBB、AABB，B錯誤；過程④和⑤分別是脫分化和再分化，C錯誤；通過植物體細胞雜交獲得的植株d，因為細胞中有同源染色體存在，在減數(shù)分裂時，同源染色體能正常配對，所以理論上是可育的，D正確。課時對點練[分值：100分]第1～9題，每題6分；第10～11題，每題7分，共68分。題組一細胞的全能性1．(2023·南京高二期末)下列有關細胞全能性的敘述，正確的是()A．玉米種子萌發(fā)長成新植株，說明植物細胞具有全能性B．植物體只有體細胞才具有發(fā)育成完整個體所必需的全部基因C．用花粉培育成的植株往往高度不育，說明花粉細胞不具有全能性D．利用植物組織培養(yǎng)技術培育花卉的原理是植物細胞具有全能性答案D解析玉米種子萌發(fā)長成新植株屬于自然生長過程，不能體現(xiàn)細胞的全能性，A錯誤；植物體的體細胞和生殖細胞都具有發(fā)育成完整個體所必需的全部基因，B錯誤；用花粉培育成植株，可體現(xiàn)花粉細胞具有全能性，C錯誤。2．利用植物的花瓣就能培育出完整的植株，下列相關敘述不正確的是()A．組成花瓣的細胞具有全能性B．花瓣細胞中有個體發(fā)育所需要的全套遺傳物質C．利用花瓣培育出完整的植株涉及細胞分裂和細胞分化D．在生物的生長發(fā)育過程中，細胞都能表現(xiàn)出全能性答案D解析花瓣細胞屬于植物的體細胞，因其細胞中具有個體發(fā)育所需要的全套遺傳物質，所以花瓣細胞具有全能性，A、B正確；在生物的生長發(fā)育過程中，并不是所有的細胞都能表現(xiàn)出全能性，而是分化為各種組織和器官，由花瓣培育出完整植株，其前提是花瓣必須離體培養(yǎng)，且處于適宜的培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)過程中涉及細胞分裂和細胞分化，C正確，D錯誤。題組二植物組織培養(yǎng)3．關于“菊花的組織培養(yǎng)”的實驗操作，下列說法錯誤的是()A．培養(yǎng)基連同其他器械一起進行高壓蒸汽滅菌B．幼苗要先移植到消過毒的蛭石或者珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間C．培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素含量的比值顯著高于1時，可促進愈傷組織分化出根D．接種時用鑷子夾取菊花莖段全部插入培養(yǎng)基中即可答案D解析接種時用鑷子夾取菊花莖段，將其1/3～1/2插入培養(yǎng)基中，注意形態(tài)學上端朝上，D錯誤。4．菊花組織培養(yǎng)過程中，需要用到①誘導愈傷組織培養(yǎng)基、②誘導生根培養(yǎng)基和③誘導生芽培養(yǎng)基。下列有關敘述正確的是()A．菊花的幼莖莖段在離體培養(yǎng)過程中，最后用到的培養(yǎng)基是③B．若接種的外植體是花藥，則離體培養(yǎng)得到的植株都是單倍體C．培養(yǎng)基中含有營養(yǎng)物質，故誘導愈傷組織、生根、生芽期間都不需要光照D．生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵激素答案D解析再分化過程中，先誘導生芽，后誘導生根，菊花的幼莖莖段在離體培養(yǎng)過程中最后用到的培養(yǎng)基是②，A錯誤；花藥包括花藥壁(一種體細胞)和花粉，如果由花藥壁發(fā)育而來，則是二倍體，B錯誤；誘導愈傷組織期間一般不需要光照，后續(xù)誘導生芽、生根過程中，每日需要給予適當時間和強度的光照，C錯誤。5．下列關于植物組織培養(yǎng)的敘述，錯誤的是()A．培養(yǎng)基中添加蔗糖可以提供營養(yǎng)和調(diào)節(jié)滲透壓B．過程甲、乙中生長素與細胞分裂素含量的比值相同C．同一株綠色開花植物不同部位的細胞經(jīng)培養(yǎng)獲得的愈傷組織細胞核基因數(shù)目可能不同D．過程乙的實質是基因的選擇性表達答案B解析甲表示脫分化過程，乙表示再分化過程，兩過程中生長素和細胞分裂素含量的比值不同，B錯誤；同一植株不同部位的細胞經(jīng)培養(yǎng)獲得的愈傷組織細胞核基因數(shù)目不一定相同，如花粉細胞經(jīng)培養(yǎng)形成的愈傷組織細胞的核基因數(shù)目只有體細胞的一半，C正確。題組三植物體細胞雜交技術6．設計植物體細胞雜交實驗是為獲得性狀優(yōu)良的新品種作物，通常不需要考慮的是()A．選擇具有優(yōu)良性狀的親本B．選擇去除細胞壁的酶C．親本間存在的生殖隔離D．培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的濃度及比例答案C解析植物體細胞雜交技術可打破生殖隔離，實現(xiàn)不同生物間的遠緣雜交育種，故通常不需要考慮親本間存在的生殖隔離，C符合題意。7．(2023·江蘇，13)研究者通過體細胞雜交技術，探索利用條斑紫菜和擬線紫菜培育雜種紫菜。下列相關敘述正確的是()A．從食用紫菜的動物消化道內(nèi)提取蛋白酶，用于去除細胞壁B．原生質體需在低滲溶液中長期保存，以防止過度失水而死亡C．檢測原生質體活力時可用苯酚品紅或甲紫溶液處理，活的原生質體被染色D．聚乙二醇促進原生質體融合后，以葉綠體顏色等差異為標志可識別雜種細胞答案D解析從食用紫菜的動物消化道內(nèi)提取蛋白酶，不能用于去除細胞壁，因為紫菜細胞的細胞壁成分主要為纖維素和果膠，A錯誤；獲得的原生質體若處在低滲溶液中，會吸水漲破，B錯誤；檢測原生質體活力時可用臺盼藍染色，活的原生質體不能被染色，C錯誤；聚乙二醇作為誘導劑可促進原生質體融合，對于雜種細胞可以以葉綠體顏色等差異為標志來進行識別，D正確。8．(2024·徐州高二調(diào)研)如圖為番茄(2n＝24)和馬鈴薯(4n＝48)體細胞雜交示意圖，①～⑤表示過程，a～f表示結構。下列相關說法錯誤的是()A．a(chǎn)和b均為原生質體，②過程可采用電融合法、離心法或PEG融合法B．③為再生細胞壁，c的形成是原生質體誘導融合成功的標志C．④過程通常需要避光培養(yǎng)，e需培養(yǎng)在無菌的容器中D．圖中雜種植株理論上為可育的六倍體，每個染色體組中染色體數(shù)相同答案B解析③為再生細胞壁，c為整合的原生質體，d為雜種細胞，原生質體誘導融合成功的標志是再生出細胞壁，B錯誤。9．(2024·湖北，11)植物甲抗旱、抗病性強，植物乙分蘗能力強、結實性好?？蒲腥藛T通過植物體細胞雜交技術培育出兼有甲、乙優(yōu)良性狀的植物丙，過程如圖所示。下列敘述錯誤的是()A．過程①中酶處理的時間差異，原因可能是兩種親本的細胞壁結構有差異B．過程②中常采用滅活的仙臺病毒或PEG誘導原生質體融合C．過程④和⑤的培養(yǎng)基中均需要添加生長素和細胞分裂素D．可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株答案B解析酶解是為了去除植物細胞的細胞壁，過程①中酶處理的時間不同，說明兩種親本的細胞壁結構有差異，A正確；過程②為原生質體的融合，常用化學試劑如PEG誘導原生質體融合，滅活的仙臺病毒可誘導動物細胞融合，不能用于植物原生質體融合，B錯誤；過程④脫分化和⑤再分化的培養(yǎng)基中均需要添加生長素和細胞分裂素，但二者在兩過程中的比例不同，C正確；植物丙是植物甲和植物乙體細胞雜交形成的個體，應具備兩者的遺傳物質，因此可通過分析植物丙的染色體，來鑒定其是否為雜種植株，D正確。10．(多選)植物體細胞通常被誘導為愈傷組織后才能表現(xiàn)全能性。研究發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的中層細胞是根或芽再生的源頭干細胞，其在不同條件下，通過基因的特異性表達調(diào)控生長素、細胞分裂素的作用，表現(xiàn)出不同的效應(如表)。已知生長素的生理作用大于細胞分裂素時有利于根的再生；反之，有利于芽的再生。下列推論合理的是()條件基因表達產(chǎn)物和相互作用效應①WOX5維持未分化狀態(tài)②WOX5＋PLT誘導出根③WOX5＋ARR2，抑制ARR5誘導出芽A.WOX5失活后，中層細胞會喪失干細胞特性B．WOX5＋PLT可能有利于愈傷組織中生長素的積累C．ARR5促進細胞分裂素的積累或提高細胞對細胞分裂素的敏感性D．體細胞中生長素和細胞分裂素的作用可能相互抑制答案ABD解析根據(jù)表格信息可知，WOX5能維持細胞未分化狀態(tài)，若WOX5失活后，中層細胞會喪失干細胞分裂能力強、分化程度低的特性，A合理；生長素的生理作用大于細胞分裂素時有利于根的再生，再結合表格信息，WOX5＋PLT可誘導出根，可推測WOX5＋PLT可能有利于愈傷組織中生長素的積累，B合理；生長素的生理作用小于細胞分裂素時有利于芽的再生，而抑制ARR5能誘導出芽，故可推測ARR5抑制細胞分裂素的積累或降低細胞對細胞分裂素的敏感性，C不合理；由題干信息可知，出芽或出根都是生長素與細胞分裂素含量不均衡時才會發(fā)生，故可推測體細胞中生長素和細胞分裂素的作用可能相互抑制，D合理。11．(多選)組培苗在移栽前一般需要煉苗，目的是提高組培苗對外界環(huán)境條件的適應性。如圖是不同煉苗方式組合對白蘭地紅楓組培苗移栽存活率的影響，下列有關敘述正確的是()A．煉苗初期的環(huán)境應與培養(yǎng)時的環(huán)境條件相似，不能與室外環(huán)境相同B．開蓋煉苗期間應控制的環(huán)境條件為：無菌、無光，并保持一定的濕度C．圖中白蘭地紅楓組培苗的最佳煉苗方式是閉蓋煉苗6d后，再開蓋煉苗2dD．白蘭地紅楓組培苗的移栽存活率隨著閉蓋煉苗時間的增加而升高答案AC解析煉苗前期應和培養(yǎng)時的環(huán)境條件相似；煉苗后期則要與外界環(huán)境中的栽培條件相似，從而達到逐步適應外界環(huán)境的目的，A正確；組織培養(yǎng)期間需要無菌操作，開蓋煉苗期間不需要無菌的環(huán)境，應和外界環(huán)境中栽培條件相似，且長成幼苗后應照光，使幼苗進行光合作用，B錯誤；分析題圖可知，閉蓋煉苗6d后，再開蓋煉苗2d，組培苗的移栽存活率最高，是白蘭地紅楓組培苗的最佳煉苗方式，C正確；分析題圖可知，在相同開蓋煉苗天數(shù)下，白蘭地紅楓組培苗的移栽存活率隨著閉蓋煉苗時間的增加先升高后降低，D錯誤。12．(16分)如圖表示菊花莖段細胞通過無菌操作接種到試管培養(yǎng)基上后，在一定的條件下，形成試管苗的培育過程。請據(jù)圖回答下列問題：(1)要促進細胞分裂生長，培養(yǎng)基中應含有營養(yǎng)物質和激素。營養(yǎng)物質包括________和小分子有機物，激素包括細胞分裂素和________兩類植物激素。(2)此過程依據(jù)的原理是_______________。A和B階段主要進行的分裂方式是____________，B階段除了細胞分裂外，還進行細胞________等。(3)此過程要無菌操作，主要是指對______________進行滅菌處理。B階段需要光照，原因是_______________________________________________________________________________。(4)試管苗的根細胞沒