第2章

細(xì)胞工程動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體

植物體細(xì)胞雜交技術(shù)打破生殖隔離,實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種。

有沒有技術(shù)讓不同種動物的體細(xì)胞雜交，培育出集中不同細(xì)胞優(yōu)勢于一身的動物細(xì)胞呢？實(shí)例：1970年，人-鼠細(xì)胞熒光標(biāo)記融合實(shí)驗(yàn)——動物細(xì)胞融合技術(shù)一、動物細(xì)胞融合技術(shù)

動物細(xì)胞進(jìn)行融合，與植物細(xì)胞融合有哪些不同之處？動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁阻礙細(xì)胞融合，沒有去除細(xì)胞壁的操作。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1.概念：兩個(gè)或多個(gè)動物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。2.原理：細(xì)胞膜具有一定的流動性。得到的細(xì)胞叫雜交細(xì)胞，是單核細(xì)胞。3.誘導(dǎo)融合的方法：PEG融合法（化學(xué)法）、電融合法（物理法）、滅活病毒誘導(dǎo)法等動物細(xì)胞融合特有的方法。滅活是指用物理或化學(xué)方法使病毒失去感染能力，但是并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)融合的機(jī)理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程：滅活的病毒顆粒粘附于細(xì)胞表面使細(xì)胞互相凝聚細(xì)胞膜融合細(xì)胞膜打開細(xì)胞質(zhì)融合細(xì)胞核融合形成雜交細(xì)胞實(shí)例：19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的

病理組織中觀察到多核細(xì)胞。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)4.意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。5.應(yīng)用：研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。特別是雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。

如右圖所示，采用PEG融合法、電融合法或滅活的病毒誘導(dǎo)A、B兩類動物細(xì)胞融合？思考：1.A細(xì)胞和B細(xì)胞一定要來自同一個(gè)物種嗎？2.最多考慮細(xì)胞兩兩融合的情況下，經(jīng)過促融后的培養(yǎng)液中存在多少種細(xì)胞？不用是同一物種。5種，A-A、B-B、A-B（雜交細(xì)胞）、A、B植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志意義主要用途細(xì)胞膜具有一定的流動性植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、高Ca2+-高pH融合法；離心法、聚乙二醇（PEG）融合法聚乙二醇（PEG）融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較傳統(tǒng)的抗體的獲得方法：一個(gè)抗原通常含有多種不同的抗原決定簇注射抗原一個(gè)B淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生一種抗體，該抗體識別并結(jié)合一種抗原決定簇產(chǎn)量低；純度低；特異性差。多種抗體向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。產(chǎn)生多種抗體的B細(xì)胞怎樣才能獲得大量單一的某種抗體？大量制備單一抗體的思路：單一B淋巴細(xì)胞每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體

選擇克隆單一B淋巴細(xì)胞的子細(xì)胞群大量純度高、特異性強(qiáng)的抗體產(chǎn)生在體外培養(yǎng)條件下，一個(gè)B淋巴細(xì)胞不可能無限增殖的。怎樣才能使B細(xì)胞在產(chǎn)生抗體的同時(shí)，具備無限增殖能力呢？一個(gè)極富創(chuàng)造力的方案：骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體二、單克隆抗體及其應(yīng)用注射特定的抗原1.過程：用特定抗原對小鼠免疫，并從其脾中獲取能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合誘導(dǎo)融合用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選：在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長。雜交瘤細(xì)胞（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔內(nèi)單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體

已免疫的B淋巴細(xì)胞多種雜交細(xì)胞二、單克隆抗體及其應(yīng)用分析單克隆抗體的制備過程：（1）B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)融合后（若融合的話，只考慮兩兩融合），培養(yǎng)基中共出現(xiàn)幾類細(xì)胞？其中融合的細(xì)胞有幾類？多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合誘導(dǎo)融合多種雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞篩選（2）誘導(dǎo)細(xì)胞融合后的篩選目的是什么？怎么篩選？篩選出的細(xì)胞有什么特點(diǎn)？共有5類細(xì)胞。其中融合的細(xì)胞有3類。目的是篩選出雜交瘤細(xì)胞。方法是用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體?！就卣埂?/p>

單克隆抗體培養(yǎng)過程中選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞的原理B淋巴細(xì)胞（B）骨髓瘤細(xì)胞（A）D途徑S途徑合成DNAD途徑××細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。免疫的B淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不能在體外長期存活。鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖。如果它的D途徑被阻斷的話，它會因不能合成DNA而死亡。請根據(jù)上述資料提出篩選出雜交瘤細(xì)胞的方法？A、B、A-A、B-B、A-B培養(yǎng)基中加入氨基蝶呤。二、單克隆抗體及其應(yīng)用分析單克隆抗體的制備過程：雜交瘤細(xì)胞（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞（3）篩選出雜交瘤細(xì)胞之后的篩選目的是什么？方法是什么？其原理是什么？目的是篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。方法是抗體檢測（抗原-抗體雜交）。其原理是抗原-抗體的特異性結(jié)合。由于初次篩選出的雜交瘤細(xì)胞有多種，且融合細(xì)胞中染色體可能會隨機(jī)丟失，導(dǎo)致部分雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)會失去增殖或分泌抗體的能力，因此后續(xù)需要經(jīng)過多次篩選出能產(chǎn)生專一抗體的雜交瘤細(xì)胞?！就卣埂?/p>

雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測和克隆化培養(yǎng)將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個(gè)，通過培養(yǎng)讓其增殖。多孔細(xì)胞培養(yǎng)板然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。二、單克隆抗體及其應(yīng)用分析單克隆抗體的制備過程：（4）培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法有哪些？從哪里收集產(chǎn)物？方法的優(yōu)缺點(diǎn)？抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到腹腔單克隆抗體注入動物腹腔內(nèi)培養(yǎng)和在體外培養(yǎng)液中培養(yǎng)。動物腹水中收集、在培養(yǎng)液中收集。腹腔中培養(yǎng)易于控制培養(yǎng)條件（如無需提供無菌環(huán)境等），操作簡單，成本較低，缺點(diǎn)是規(guī)模小，產(chǎn)量少；體外培養(yǎng)可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產(chǎn)，缺點(diǎn)是需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對較高?！就卣埂?/p>

抗體的人源化

利用小鼠獲得的單克隆抗體，能直接用于人體嗎？為什么？不能，單克隆抗體會被人體當(dāng)做抗原，發(fā)生免疫反應(yīng)。單克隆抗體的應(yīng)用資料1：用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”，在妊娠第8天就可以做出診斷，這比原來的診斷提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。單克隆抗體的應(yīng)用資料2：使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w—藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugate，ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細(xì)胞毒素）三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示。ADC的作用機(jī)制示意圖單克隆抗體的應(yīng)用討論：1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？

抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞。

藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。單克隆抗體的應(yīng)用討論：2.除了細(xì)胞毒素外，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？

可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療；

一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。單克隆抗體的應(yīng)用討論：3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？

單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原發(fā)生反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒。ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.優(yōu)點(diǎn)：（2）

能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異。（1）

與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合。（3）

可以大量制備。特異性強(qiáng)靈敏度高可大量制備3.應(yīng)用：（1）廣泛用作診斷試劑

利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。（2）運(yùn)載藥物

“生物導(dǎo)彈”--靶向運(yùn)輸藥物治療疾病（3）直接用于治療疾病請用箭頭把以下部分步驟的字母按正確順序連接起來。BAECGDHF甲狀旁腺激素（PTH）水平是人類多種疾病的重要診斷指標(biāo)。研究者制備單克隆抗體用于快速檢測PTH，有關(guān)制備過程的敘述不正確的是（）A．需要使用動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)B．需要制備用PTH免疫的小鼠C．利用抗原-抗體結(jié)合的原理篩選雜交瘤細(xì)胞D．篩選能分泌多種抗體的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞D

利用細(xì)胞融合技術(shù)可以制備單克隆抗體，下列關(guān)于該過程的敘述正確的是（）A．雜交瘤細(xì)胞能無限增殖，無需進(jìn)行傳代培養(yǎng)B．利用抗原抗體反應(yīng)即可篩選出雜交瘤細(xì)胞C．外界抗原多次刺激動物可以提高動物體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞的數(shù)量D．體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞需提供CO?以維持培養(yǎng)液的pHD

如圖所示，將由2種不同的抗原分別制備的單克隆抗體分子，在體外解偶聯(lián)后重新偶聯(lián)可制備雙特異性抗體，簡稱雙抗。下列說法錯(cuò)誤的是（

）A．雙抗可同時(shí)與2種抗原結(jié)合B．利用雙抗可以將蛋白類藥物運(yùn)送至靶細(xì)胞C．篩選雙抗時(shí)需使用制備單克隆抗體時(shí)所使用的2種抗原D．同時(shí)注射2種抗原可刺激B細(xì)胞分化為產(chǎn)雙抗的漿細(xì)胞D

新型冠狀病毒表面的刺突蛋白(S蛋白)與人呼吸道黏膜上皮細(xì)胞ACE2受體結(jié)合，入侵細(xì)胞后可引起肺炎。針對此環(huán)節(jié)研發(fā)單克隆抗體是治療新冠肺炎的研究熱點(diǎn)之一，下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A.①過程需多次向小鼠體內(nèi)注射S蛋白，以便于從脾臟中獲得致敏的B淋巴細(xì)胞B.②過程可通過電融合法使兩個(gè)細(xì)胞融合C.經(jīng)③過程篩出的細(xì)胞既能無限增殖又能產(chǎn)生識別S蛋白的單克隆抗體D.S蛋白的單克隆抗體能夠阻斷病毒入侵正常細(xì)胞以減弱對機(jī)體的毒害C

抗體—藥物偶聯(lián)物(ADC)通過將細(xì)胞毒素與單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，過程如圖所示。下列敘述不正確的是()A.抗體進(jìn)入細(xì)胞后激活溶酶體酶，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡B.ADC可通過胞吞方式進(jìn)入腫瘤細(xì)胞C.單克隆抗體攜帶細(xì)胞毒素與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合D.腫瘤細(xì)胞凋亡是細(xì)胞主動死亡的過程，會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)A

乳腺癌化療的藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會對健康細(xì)胞造成傷害，為降低藥物對患者的副作用，科研人員嘗試在單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建抗體一藥物偶聯(lián)物（ADC），過程如圖所示。下列相關(guān)說法正確的是(

)A.對①過程形成的雜交細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可以獲得能分泌所需抗體的細(xì)胞B.ADC通常由抗體、接頭和藥物三部分組成，ADC起作用時(shí)會被細(xì)胞吞噬，并在溶酶體內(nèi)被分解后釋放藥物C.經(jīng)步驟③篩選得到的雜交瘤細(xì)胞具有的特點(diǎn)是能準(zhǔn)確識別抗原的細(xì)微差異并能大量制備D.