怎樣培養(yǎng)出具有抗蟲性狀的抗蟲棉呢？

我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國，棉花在種植過程中常常會受到棉鈴蟲的侵襲，這會使棉花大量減產(chǎn)。大量施用農(nóng)藥不僅提高了生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染，如果能培育出自身能抵抗棉鈴蟲的棉花就能解決這個問題。

棉花本身不具有“殺蟲基因”，而蘇云金桿菌有一種“殺蟲基因”，它能通過編碼產(chǎn)生抗蟲蛋白來殺死棉鈴蟲。一、基因工程的誕生和發(fā)展閱讀教材證明DNA是遺傳物質(zhì)建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，提出自我復(fù)制假說發(fā)現(xiàn)DNA、質(zhì)?？梢栽诩毦毎g轉(zhuǎn)移發(fā)現(xiàn)限制酶、DNA連接酶、逆轉(zhuǎn)錄酶證明可以用質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA，外源基因可以在原核細胞中成功表達，實現(xiàn)種間基因交流首次體外構(gòu)建重組DNA分子1944艾弗里1953沃森、克里克證明DNA自我復(fù)制1958梅塞爾森、斯塔爾提出中心法則1958克里克1944艾弗里·1967基因可以控制性狀1970可以拼接產(chǎn)生新基因1972伯格1973性狀轉(zhuǎn)移基因工程基因組編輯技術(shù)2013主線Ⅰ一、基因工程的誕生和發(fā)展閱讀教材首次完成胰島素氨基酸測序發(fā)明DNA序列分析方法，DNA合成儀問世發(fā)明PCR技術(shù)發(fā)明高通量測序技術(shù)主線Ⅱ基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。基因工程：是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫

重組DNA技術(shù)1.操作環(huán)境：2.原理：3.操作對象：4.操作水平：5.結(jié)果：體外環(huán)境基因分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品定向改造生物性狀；克服遠緣雜交不親和障礙6.意義：二、基因工程【典例1】人的胰島素基因能通過拼接并在受體細胞大腸桿菌中表達出相同蛋白質(zhì)--胰島素的理論基礎(chǔ)是？（1）大腸桿菌和人的遺傳物質(zhì)都是

。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是：

。

（3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達出來的蛋白質(zhì)相同，因為：

。（4）遺傳信息的傳遞都遵循

。(5)

為什么一種生物的基因可以在另一種生物細胞內(nèi)表達？

。

DNA中心法則基本組成單位、空間結(jié)構(gòu)（規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)）和堿基互補配對方式相同所有生物共用一整套遺傳密碼①基因是控制生物性狀的結(jié)構(gòu)和功能單位②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則③生物界共同一套遺傳密碼二、基因工程理論基礎(chǔ)：基因拼接：①基本組成單位都是四種脫氧核苷酸②都遵循堿基互補配對原則③都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)外源基因表達：①基因是控制生物性狀的遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能單位②遺傳信息的傳遞都遵循中心法則③生物界共用一套遺傳密碼二、基因工程第3章第1節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本工具資料1：棉花本身不具有“殺蟲基因”，而蘇云金桿菌有一種“殺蟲基因”，它能通過編碼產(chǎn)生抗蟲蛋白來殺死棉鈴蟲。資料2：番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒?！胺肿舆\輸車”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“工欲善其事必先利其器”目錄Contents1限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”2DNA連接酶--“分子縫合針”3基因進入受體細胞的載體--“分子運輸車”01限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”主要是原核生物來源1、識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列作用特點2、斷開特定部位的磷酸二酯鍵5'3'5'3'TAGGTATCCA①②【例】斷開

。①資料11970年，史密斯（H.D.Smith)等人首次從大腸桿菌中提取出了一種限制性內(nèi)切核酸酶（restrictionendonuclease)。這種內(nèi)切核酸酶能夠識別特定的脫氧核苷酸序列，并在特異性的位點上把雙鏈DNA分子“切割”開（如圖)。DNA被切割后所產(chǎn)生的交錯的切口，也就是在每條鏈的一端留下的單鏈末端，叫做黏性末端。一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”AGTCATTCGATAGGATCATCATAT

大腸桿菌(E.coli)的EcoRⅠ限制酶能特異性識別_________序列，并切割___和___之間的____________。切割后產(chǎn)生__________。GAATTCGA磷酸二酯鍵黏性末端EcoRI一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”SmaI限制酶只能識別

序列，切割

和

之間的

切開，切割后產(chǎn)生

。CCCGGGCG磷酸二酯鍵平末端SmaICCCGGGGGGCCCGGGCCCCCCGGGEcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’BamHⅠ5’…G-G-A-T-C-C…3’3’…C-C-T-A-G-G…5’TaqⅠ5’……T-C-G-A……3’3’……A-G-C-T……5’1.一個限制酶切割一次斷

個磷酸二酯鍵形成___個黏性末端2.同一種限制酶切割形成的黏性末端____兩相同一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”回文序列形成黏性末端或平末端結(jié)果兩1.你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？2.為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶的作用：切割外源DNA,使之失效保證自身的安全DNA分子中不具備這種限制酶的識別切割序列，或者DNA分子被修飾（甲基化），使限制酶不能將其切開—CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA——GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT——CTACGATG—GATGCTACTTAAAATTCCCTAA—GGGATT—黏性末端【典例1】使用EcoRI剪切目的基因，寫出切割后的序列一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”【典例2】要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾次？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？要切兩次，產(chǎn)生四個黏性(平)末端。目的基因AATTCCGTAGGGCATCTTAAG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

AA

TT

CC

TT

AA

GG

C

TT

AA

AA

TT

C

GGC

TT

AA

AA

TT

C

G用同種限制酶切割(EcoRⅠ)【典例3】把兩種來源不同的DNA進行重組，應(yīng)該怎樣處理？一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”

缺口怎么辦？G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

G一、限制性核酸內(nèi)切酶--“分子手術(shù)刀”【典例3】把兩種來源不同的DNA進行重組，應(yīng)該怎樣處理？02DNA連接酶--“分子縫合針”資料21967年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)蓚€DNA片段連接起來的酶，可以用它來修復(fù)DNA鏈的斷裂口，并把這種酶叫做DNA連接酶。1970年，科學(xué)家們又提取了一種具有更高活性的T4DNA連接酶。當(dāng)兩個DNA片段的黏性末端彼此相臨，而且它們的堿基能夠互補配對時，DNA連接酶就能把它們之間的縫隙“縫合”起來（如圖）。二、DNA連接酶--“分子縫合針”

將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的

，形成重組DNA分子。作用分類種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源作用相同點大腸桿菌T4噬菌體只連接黏性末端既可以連接黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（效率較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵二、DNA連接酶--“分子縫合針”磷酸二酯鍵AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶二、DNA連接酶--“分子縫合針”比較DNA連接酶和DNA聚合酶

AA

TT

C

GGCTTAADNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶DNA聚合酶相同點作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點模板作用對象

作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上兩個DNA片段二、DNA連接酶--“分子縫合針”比較DNA連接酶和DNA聚合酶【典例4】根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA連接酶④DNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_______

B.連接a處的酶為_______C.切斷b處的酶為_______①③④②二、DNA連接酶--“分子縫合針”03基因進入受體細胞的載體--“分子運輸車”資料41973年，美國科學(xué)家科恩（S.Cohen)等人從大腸桿菌中提取出了兩種質(zhì)粒，一種含有卡那霉素抗性基因，另一種含有四環(huán)素抗性基因。他們將這兩種基因分別“切割”下來，并拼接在同一個質(zhì)粒上，然后導(dǎo)入大腸桿菌，產(chǎn)生了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的大腸桿菌。三、基因進入受體細胞的載體--“分子運輸車”作用種類三、基因進入受體細胞的載體--“分子運輸車”作為載體需具備的條件將外源基因送入受體細胞。質(zhì)粒（最常用）動植物病毒噬菌體①能夠在受體細胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復(fù)制。②具一個或多個限制酶切點，供外源DNA插入其中。③具有特殊的標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細胞核或擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的

（化學(xué)本質(zhì)），故質(zhì)粒有

個游離的磷酸基團②質(zhì)粒上的氨芐青霉素抗性基因為

，還有如：

等；其作用是：

。雙鏈環(huán)狀DNA分子0標(biāo)記基因用于鑒別和篩選含有目的基因的受體細胞四環(huán)素抗性基因三、基因進入受體細胞的載體--“分子運輸車”③在進行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。存在于許多細菌及酵母菌等生物中利用標(biāo)記基因進行篩選示例：重組DNA導(dǎo)入受體細胞不是100%，而且導(dǎo)入率較低標(biāo)記基因的篩選原理：載體上的標(biāo)記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導(dǎo)入受體細胞，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，受體細胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導(dǎo)入了載體的受體細胞。噬菌體或某些動植物病毒作為運載體利用的原理是：病毒對宿主細胞的侵染具有一定的

性。利用病毒對宿主細胞的侵染性特異若用家蠶作為某基因表達載體的受體細胞，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是：噬菌體噬菌體的宿主細胞是細菌，而不是家蠶三、基因進入受體細胞的載體--“分子運輸車”噬菌體、動植物病毒【典例5】（1）質(zhì)粒與擬核中的DNA有哪些相同點：（至少寫出兩點）

①

。

②

。

③

。（2）質(zhì)粒

（是/不是）一種細胞器。（3）細胞膜上的載體蛋白與基因工程中的載體的區(qū)別

①化學(xué)本質(zhì)不同：細胞膜上的載體：

。基因工程中的載體可能是物質(zhì)，如

；也可是生物，如

或噬菌體。

②功能不同：細胞膜上的載體功能是

;基因工程中的載體是一種“分子運輸車”,把

。化學(xué)本質(zhì)和結(jié)構(gòu)相同能夠自我復(fù)制具有遺傳效應(yīng)或都能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成等不是蛋白質(zhì)質(zhì)粒動植物病毒控制物質(zhì)進出細胞目的基因?qū)胧荏w細胞重組DNA分子請在兩張紙上分別寫上下面兩段DNA序列：

請你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI的識別序列和切割位點。然后,用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后,將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處,并用透明膠條將切口粘連起來。1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”?剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。重組DNA分子請在兩張紙上分別寫上下面兩段DNA序列：

請你根據(jù)圖3-3中的相關(guān)信息找到兩條片段上EcoRI的識別序列和切割位點。然后,用剪刀進行“切割”。待切割位點全部切開后,將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處,并用透明膠條將切口粘連起來。

2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？你能用DNA連接酶將他們連接起來嗎？1和

；2和

；4和

。3、6、758限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開么？以下四種不同限制酶切割形成的DNA片段：2

已知BamHⅠ的識別序列和切點是—G↓GATCC—，Sau3AⅠ的識別序列和切點是—↓GATC—BamHⅠSau3AⅠ不同限制酶切割形成的黏性末端可能相同。且連接后不能再被原來的限制酶識別。

多否【典例7】下列有關(guān)如圖所示的黏性末端的說法，錯誤的是(

)【典例6】質(zhì)粒是基因工程中最常用的運載體，它的主要特點是（）①能自主復(fù)制②不能自主復(fù)制③結(jié)構(gòu)很小④蛋白質(zhì)⑤環(huán)狀RNA⑥環(huán)狀DNA⑦能“友好”地“借居”A．①③⑤⑦ B．①④⑥C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦CCA.甲、乙、丙黏性末端分別是由不同的限制酶切割產(chǎn)生的B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重組DNA分子，但甲、丙不能C.DNA連接酶的作用位點是b處D.切割產(chǎn)生甲的限制酶不能識別由甲、乙黏性末端形成的重組DNA分子片段【典例8】如表為常用的限制酶及其識別序列和切割位點，據(jù)表分析以下說法正確的是(

)限制酶BamHⅠEcoRⅠHindⅡ識別序列和切割位點G↓GATCCG↓AATTCGTY↓RAC限制酶KpnⅠSau3AⅠSmaⅠ識別序列和切割位點GGTAC↓C↓GATCCCC↓GGG(注：Y表示C或T，R表示A或G)DA.一種限制酶只能識別一種脫氧核苷酸序列B.限制酶的切割位點一定位于識別序列的內(nèi)部C.不同限制酶切割后一定形成不同的黏性末端D.限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端【典例9】圖甲是含有目的基因的外源DNA片段，圖乙是用于將目的基因?qū)胧荏w細胞的質(zhì)粒（陰影部分表示抗生素抗性基因），相關(guān)限制酶的作用部位如圖所示，現(xiàn)欲培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因抗病植株，回答下列問題。（1）上述操作中不宜選用SmaI，原因是SmaI會破壞__________和_____________。（2）在基因工程的操作中，不宜選用EcoRI，原因是用EcoRI切割外源DNA片段后，__________________________________________________。目的基因抗性基因目的基因只有一側(cè)含有黏性末端，不能插入到質(zhì)粒中(1)在培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)該選擇的限制酶為_______。(2)在培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)該選擇的限制酶為_____。①或②①選用下圖載體將目的基因?qū)爰毦胁⒑心康幕虻募毦Y選出來?！镜淅?0】用限制酶EcoRⅤ單獨切割某質(zhì)粒，可產(chǎn)生1個14kb(1kb即1000個堿基對)的長鏈，而同時用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ聯(lián)合切割該質(zhì)粒，可得到三種長度的DNA片段，見下圖(其中*表示EcoRⅤ切割后的一個黏性末端)。若用MboⅠ單獨切割該質(zhì)粒，則產(chǎn)生的DNA片段的長度為(

)A.2.5kb和5.5kb B.2.5kb和6kbC.5.5kb和8kb D.6kb和8kbD一個酶切位點兩個酶切位點【典例11】在DNA測序工作中，需要將某些限制酶的限制位點在DNA上定位，使其成為DNA分子中的物理參照點。這項工作叫做“限制酶圖譜的構(gòu)建”。假設(shè)有以下一項實驗：用限制酶HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分別降解一個4kb（1kb即1千個堿基對）大小的線性DNA分子，降解產(chǎn)物分別進行凝膠電泳，在電場的作用下，降解產(chǎn)物分開，如下圖所示。據(jù)此分析，這兩種限制性內(nèi)切酶在該DNA分子上的限制位點數(shù)目分別是：嘗試在該DNA片段上畫出兩種限制酶識別位點：1個2個HindⅢBamHⅠBamHⅠ0.3kb0.9kb1.0kb1.8kb【典例12】限制酶能識別特定的DNA序列并進行剪切?，F(xiàn)以3種不同的限制性酶對一6.2kb大小的線狀DNA進行剪切后。用凝膠電泳分離各核酸片段，實驗結(jié)果如圖所示。請畫出3種不同的限制酶在此DNA片段上相應(yīng)切點的位置1個2個2個A0.30.7BCABA2.6A0.50.9C1.21.提取DNA的方法

利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。（1）提取生物大分子的基本思路

選用一定的物理或化學(xué)方法，分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子（2）提取DNA的基本思路（DNA的粗提?。緦嶒灒篋NA的粗提取與鑒定】【實驗：DNA的粗提取與鑒定】2.實驗原理提取原理：（1）DNA不溶于酒精，某些蛋白質(zhì)溶于酒精（2）在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高鑒定原理：（3）一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色0DNA溶解度NaCl濃度0.14mol/L2mol/LDNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。

不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為：哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA。3.選材：注意：試劑：①研磨液②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用【實驗：DNA的粗提取與鑒定】【實驗：DNA的粗提取與鑒定】4.實驗步驟(1)稱取約30g洋蔥,切碎,然后放入研中,倒入10mL研磨液,充分研磨。(2)在漏斗中墊上紗布,將洋蔥研磨液過濾到燒杯中,在4℃冰箱中放置幾分鐘后,再取上清液。也可以直接將研磨液倒入塑料離心管中,在1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min,再取上清液放入燒杯中。研磨不充分，會使DNA分子不能從細胞核中釋放出來，從而影響提取的DNA含量過濾能用濾紙代替嗎？不可以，因為DNA會被吸附到濾紙上而大量損失?？赡芎蠨NA、RNA以及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等。4.實驗步驟(3)在上清液中加入體積相等的、預(yù)冷的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)為95%),靜置2~3min,溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌,卷起絲狀物,并用濾紙吸去上面的水分;或者將溶液倒入塑料離心管中,在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min,棄上清液,將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。（1）冷卻的酒精溶液(體積分?jǐn)?shù)95％)作用：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。避免破壞DNA【實驗：DNA的粗提取與鑒定】這一步的目的是蛋白質(zhì)溶解在酒精中，DNA不溶于酒精而析出。(4)取兩支20mL的試管,各加入2mol/L的NaC1溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaC1溶液中。然后,向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后,比較兩支試管中溶液顏色的變化。4.實驗步驟【實驗：DNA的粗提取與鑒定】實驗組對照組水浴加熱【請同學(xué)們補充完整以下實驗步驟】試管編號A（對照組）B（實驗組）步驟12mol/L的NaC1溶液5mL步驟2不進行任何處理步驟3步驟4沸水浴加熱5min實驗現(xiàn)象溶液不變藍色實驗結(jié)論加絲狀物或沉淀物加4mL的二苯胺試劑溶液逐漸變藍DNA在沸水浴下遇二苯胺試劑，冷卻后會呈現(xiàn)藍色一、CA二、練習(xí)與應(yīng)用1.因為含有某種限制酶的細胞的DNA分子或者不具備這種限制酶的識別序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)