第2節(jié)基因工程的基本操作程序第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建[學(xué)習(xí)目標(biāo)]1.簡(jiǎn)述PCR的原理、條件及過(guò)程。2.簡(jiǎn)述基因表達(dá)載體的組成及構(gòu)建過(guò)程。一、目的基因的篩選與獲取1．培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的四個(gè)步驟(1)目的基因的____________。(2)____________的構(gòu)建。(3)將目的基因?qū)隷_______。(4)目的基因的________。2．目的基因(1)概念：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期__________等的基因就是目的基因。(2)作用：根據(jù)不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指______________的基因。(3)類型：與________、________、________和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因，如培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的________________，即Bt基因。3．篩選合適的目的基因：從___________________的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。4．獲取目的基因的方法(1)人工合成目的基因。(2)常用________特異性地快速擴(kuò)增目的基因。(3)通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。5．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)含義：PCR是________________的縮寫。它是一項(xiàng)在體外提供參與DNA復(fù)制的____________與____________，對(duì)目的基因的______________進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。(2)原理：____________。(3)基本條件①場(chǎng)所：在一定的__________液中進(jìn)行，其中一般要添加Mg2＋。②模板：DNA母鏈。③原料：4種________。④酶：________的DNA聚合酶。⑤引物：使DNA聚合酶能夠從引物的____端開始連接脫氧核苷酸。(4)過(guò)程①變性：當(dāng)溫度超過(guò)____℃時(shí)，雙鏈DNA________為單鏈。②復(fù)性：當(dāng)溫度下降到____℃左右時(shí)，________通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。③延伸：當(dāng)溫度上升到____℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在________________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。(5)上一輪循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的________，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以________，即成________形式擴(kuò)增(約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù))。(6)鑒定：常采用________________來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物。判斷正誤(1)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)()(2)PCR擴(kuò)增技術(shù)中，需用解旋酶使雙鏈DNA解聚()(3)PCR過(guò)程使用的DNA聚合酶的特點(diǎn)是耐高溫()(4)PCR技術(shù)中，DNA模板鏈上堿基G和C的比例越高，DNA變性解鏈的溫度就越高()任務(wù)一：PCR擴(kuò)增技術(shù)圖1、圖2分別是PCR擴(kuò)增技術(shù)相關(guān)過(guò)程，請(qǐng)思考回答下列問(wèn)題：1．PCR擴(kuò)增的是完整的模板DNA分子嗎？并說(shuō)明理由。2．圖1所示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段？比例是多少？3．如果已知某目的基因的序列和結(jié)構(gòu)，利用PCR篩選和擴(kuò)增出該目的基因的關(guān)鍵是什么？4．圖2是某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。5．要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？6．如果循環(huán)n次，則共需消耗多少對(duì)引物？PCR中的數(shù)量關(guān)系復(fù)制次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物的DNA分子數(shù)2482n含其中一種引物的DNA分子數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1同時(shí)含兩種引物的DNA分子數(shù)0＝21－22＝22－26＝23－22n－2共消耗引物的對(duì)數(shù)1＝21－13＝22－17＝23－12n－1含脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)0＝21－20＝22－42＝23－62n－2n1．(2023·山西太原高二診斷)下列有關(guān)獲取目的基因的敘述，錯(cuò)誤的是()A．目的基因就是編碼蛋白質(zhì)的基因B．獲取目的基因是基因工程的第一步C．來(lái)自蘇云金桿菌的Bt抗蟲蛋白基因可作為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的目的基因D．序列比對(duì)工具的應(yīng)用為科學(xué)家找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)2．如圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過(guò)程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A．耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B．在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段C．引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，則不能有效擴(kuò)增目的基因D．從理論上推測(cè)，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建1．基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的讓目的基因在受體細(xì)胞中________，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠________和________。2．基因表達(dá)載體的組成3．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程(1)首先用一定的________切割載體。(2)然后用________限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。(3)再利用________將含目的基因的DNA片段拼接到載體的切口處(如圖所示)。判斷正誤(1)基因工程操作程序的核心步驟是目的基因的獲取()(2)基因表達(dá)載體中有的含有啟動(dòng)子和終止密碼子()(3)標(biāo)記基因不一定是抗生素抗性基因()任務(wù)二：分析基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的和方法1．獲取Bt基因后不能直接將它導(dǎo)入受體細(xì)胞，是因?yàn)橛坞x的DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會(huì)____________，即使可以轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無(wú)法隨著________而進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞中________________。因此，獲取Bt基因后，還需要________________________，才能使棉花植株獲得抗蟲特性。2．構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)目的基因插入的位置應(yīng)該在哪里？為什么？3．請(qǐng)結(jié)合圖示，回答下列問(wèn)題：(1)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ酶切割質(zhì)粒？為什么？(2)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？1．區(qū)分啟動(dòng)子和終止子與起始密碼子和終止密碼子啟動(dòng)子和終止子位于DNA上，是基因表達(dá)載體必需的部分，而起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束。2．圖解限制酶的選擇原則(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則：通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒，如圖中PstⅠ；為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。拓展延伸真、原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)(1)基因的結(jié)構(gòu)(2)基因表達(dá)遺傳信息①原核生物基因②真核生物基因3．下列關(guān)于基因表達(dá)載體構(gòu)建的敘述，錯(cuò)誤的是()A．啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，組成它的基本單位是脫氧核苷酸B．基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止密碼子、標(biāo)記基因等組件C．人工構(gòu)建的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可激活或抑制目的基因的表達(dá)D．由于受體細(xì)胞不同，基因表達(dá)載體的構(gòu)建也有所差別4．(2023·江蘇蘇州高二期末)某科研小組利用質(zhì)粒(圖甲)和目的基因(圖乙)構(gòu)建重組DNA。下列分析不正確的是()A．用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割質(zhì)粒，可得到2條DNA片段B．不能用AluⅠ酶切割質(zhì)粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶會(huì)破壞目的基因C．構(gòu)建重組DNA時(shí)，需選擇SmaⅠ酶和PstⅠ酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNAD．導(dǎo)入了重組DNA的細(xì)菌能在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不能在含氯霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

第2節(jié)基因工程的基本操作程序第1課時(shí)目的基因的篩選與獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建一、教材梳理1．(1)篩選與獲取(2)基因表達(dá)載體(3)受體細(xì)胞(4)檢測(cè)與鑒定2．(1)表達(dá)產(chǎn)物(2)編碼蛋白質(zhì)(3)生物抗逆性生產(chǎn)藥物毒物降解Bt抗蟲蛋白基因3．相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰4．(2)PCR5．(1)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)各種組分反應(yīng)條件核苷酸序列(2)DNA半保留復(fù)制(3)①緩沖③脫氧核苷酸④耐高溫⑤3′(4)①90解聚②50兩種引物③72耐高溫的DNA聚合酶(5)模板增加一倍指數(shù)(6)瓊脂糖凝膠電泳判斷正誤(1)×(2)×(3)√(4)√解析(1)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了變性、復(fù)性、延伸，DNA聚合酶催化子鏈的延伸。(2)PCR擴(kuò)增技術(shù)中，高溫使雙鏈DNA解聚。核心探討任務(wù)一1．不是；PCR擴(kuò)增的僅僅是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段。2．第3輪；1/4。3．根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。4．第1組：引物Ⅰ和引物Ⅱ會(huì)因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。第2組：引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效。5．要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。6．共需消耗2n－1對(duì)引物。典題應(yīng)用1．A[目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子，A錯(cuò)誤。]2．D[由題圖可知，以原來(lái)的每條母鏈為模板經(jīng)第一輪合成的兩個(gè)DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子鏈為模板合成新DNA分子時(shí)，兩種引物都含有，故第三輪循環(huán)共產(chǎn)生8個(gè)DNA分子，其中含有引物A的分子是7個(gè)，即占7/8，D錯(cuò)誤。]二、教材梳理1．穩(wěn)定存在表達(dá)發(fā)揮作用2．啟動(dòng)子上游RNA聚合酶終止子下游轉(zhuǎn)錄標(biāo)記3．(1)限制酶(2)同種(3)DNA連接酶判斷正誤(1)×(2)×(3)√解析(1)基因工程操作程序的核心步驟是基因表達(dá)載體的構(gòu)建。(2)基因表達(dá)載體中有的含有啟動(dòng)子和終止子，終止密碼子位于mRNA上。核心探討任務(wù)二1．直接被分解細(xì)胞分裂不再含有目的基因借助載體將其導(dǎo)入棉花細(xì)胞2．啟動(dòng)子下游和終止子上游；因?yàn)橹挥胁迦朐趩?dòng)子和終止子之間，目的基因才可以正常表達(dá)。3．(1)不能；因?yàn)镾maⅠ會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。該基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選，若被破壞，無(wú)法進(jìn)一步篩選。(2)可以防止質(zhì)粒和目的基因的自身環(huán)化以及目的基因與載體的反向連接。典題應(yīng)用3．B[啟動(dòng)子在基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，組成它的基本單位是脫氧核苷酸，A正確；基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因等，B錯(cuò)誤；由于受體細(xì)胞有植物、動(dòng)物以及微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法不同，因此基因表達(dá)載體的構(gòu)建是不完全相同的，D正確。]4．C[限制酶HindⅢ和PstⅠ在質(zhì)粒上各有一個(gè)識(shí)別切割位點(diǎn)，用HindⅢ和Pst