從社會中來1997年，我國政府首次批準商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。

你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？P77

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉與普通棉花3.將目的基因?qū)胧荏w細胞蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構(gòu)建4.目的基因的檢測與鑒定第3章基因工程

第2節(jié)基因工程的基本操作程序

高二生物組1.利用PCR獲取和擴增目的基因2.基因表達載體的構(gòu)建過程本節(jié)主要解決的困惑原核細胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖真核細胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達包括：編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游知識回顧1：基因的結(jié)構(gòu)原核細胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖真核細胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點，

轉(zhuǎn)錄起始的信號終止子：終止RNA的合成外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼序列=非編碼區(qū)+內(nèi)含子知識回顧1：基因的結(jié)構(gòu)知識回顧1：基因的結(jié)構(gòu)新合成的子鏈DNA聚合酶DNA聚合酶DNA解旋酶游離的脫氧核苷酸解旋需要細胞提供能量需要解旋酶的作用結(jié)果：氫鍵斷裂，雙鏈打開合成子鏈知識回顧2：DNA的復制過程

真核細胞與原核細胞中基因表達過程示意圖

知識回顧3：基因的表達1轉(zhuǎn)錄時，DNA鏈完全解開嗎？整個DNA都轉(zhuǎn)錄？轉(zhuǎn)錄不是轉(zhuǎn)錄整個DNA，是轉(zhuǎn)錄其中要表達的基因，以基因的一條鏈為模板，2不同基因的模版鏈是否相同？不同基因模板鏈不同3.同種生物的不同細胞中，由于基因的選擇性表達，mRNA的種類和數(shù)量一般是不相同的，但tRNA和rRNA的種類一般沒有差異。邊解旋邊轉(zhuǎn)錄點撥提升1【思考1】：如果把一個真核生物的基因?qū)朐思毎斜磉_，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？成熟mRNA相應酶去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質(zhì)加工一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)①原核生物細胞里沒有相應的酶來去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）深度思考【思考2】:如果把真核基因?qū)朐思毎斜磉_，不考慮蛋白質(zhì)加工的問題，如何產(chǎn)生與原來結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)？去除內(nèi)含子成熟mRNA轉(zhuǎn)錄真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）前體mRNA相應酶mRNA單鏈提取逆轉(zhuǎn)錄酶DNA單鏈DNA雙鏈酶把真核基因的cDNA導入到原核細胞中表達。這種雙鏈DNA是不含內(nèi)含子的DNA，叫做cDNA深度思考1.目的基因：在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或得預期表達產(chǎn)物等的基因，主要指的是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。2.實例：與生物抗逆性相關(guān)的基因（Bt抗蟲基因）與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因（胰島素、干擾素基因）與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等3.目的基因獲取方法：（一）從基因文庫中獲取；（二）通過DNA合成儀直接合成；（三）利用PCR技術(shù)擴增；目的基因的篩選與獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘蝎@取目的基因1.基因文庫概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。2.基因文庫類型：（未知序列）基因組文庫部分基因文庫（包含一種生物的所有基因）（cDNA文庫）（包含一種生物的一部分基因）某生物體內(nèi)全部DNA

許多DNA片段受體菌群體限制酶與運載體連接導入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導入部分基因文庫（cDNA文庫）DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學方法直接合成目的基因（二）人工合成目的基因（已知序列）1.前提：2.方法：困惑點一：利用PCR獲取和擴增目的基因PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。1.概念：DNA復制所需的基本條件參與的組分在DNA復制中的作用解旋酶（體外用高溫代替）打開DNA雙鏈DNA兩條母鏈提供DNA復制的模板4種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈與兩條母鏈結(jié)合的2種引物使DNA聚合酶能夠從引物3′端連接脫氧核苷酸2.方式：3.條件：以指數(shù)方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）2n作用（1）什么是引物？DNA復制時為什么需要引物？

（2）PCR擴增目的基因需要知道目的基因的全部核苷酸序列嗎？（3）PCR過程中需要解旋酶嗎？所需要的DNA聚合酶應具有什么特點？是指兩段與待擴增的DNA序列互補的一小段DNA或RNA。在DNA擴增時，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此克隆DNA時應加入兩種引物。不需要，只要知道目的基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。PCR過程中，DNA雙鏈解開是在高溫下完成的，不需要解旋酶；由于PCR過程溫度較高，所以需要能耐高溫的DNA聚合酶。探究要求：思考以下問題，小組合作交流，派代表展示成果，時間3min。合作交流（1）設(shè)計一對與目的基因兩側(cè)的部分脫氧核苷酸序列互補配對的引物

（保證以DNA的兩條鏈為模板進行擴增）：①為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，需在引物5’端添加適當?shù)南拗泼傅淖R別序列/酶切位點；②為保證目的基因與載體正向連接，常在兩種引物上設(shè)計不同的酶切位點；③為避免引物自身折疊，設(shè)計引物時需避免引物之內(nèi)部形成堿基互補配對。④為避免引物自連，設(shè)計引物時需避免引物之間形成局部堿基互補配對。50℃引物1引物2DNA引物95℃4.利用PCR獲取和擴增目的基因過程變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成_________b.復性（復性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，

形成局部________氫鍵單鏈DNA雙鏈模板DNA引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶c.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的

。

DNA鏈5′3′5′3′退火溫度低會造成非特異性條帶比較項目細胞內(nèi)DNA復制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細胞核內(nèi)細胞外(主要在PCR擴增儀內(nèi))酶解旋酶、DNA聚合酶等熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）溫度細胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進行結(jié)果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成知識小結(jié)：PCR技術(shù)與細胞內(nèi)DNA復制的比較第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循環(huán)5’3’5’5’3’5’高溫變性、低溫復性中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復性第三次循環(huán)3’5’中溫延伸第三次循環(huán)3’5’（2）圖形顯示一輪循環(huán)產(chǎn)生的子鏈長度小于模板鏈的長度，到第三輪循環(huán)時，才開始出現(xiàn)2個兩條脫氧核苷酸鏈等長的子代DNA。點撥提升1：PCR中的數(shù)量關(guān)系學以致用1B1.基因表達載體的組成a.目的基因b.啟動子c.終止子d.標記基因（抗生素抗性基因）表達特定性狀位于基因的首端,是RNA聚合酶結(jié)合位點，基因轉(zhuǎn)錄的開始位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導入受體細胞e、復制原點：困惑點二：基因表達載體的構(gòu)建（核心）探究要求：思考基因表達載體的組成的相關(guān)問題，小組合作交流，派代表展示成果，時間3min。合作交流DNA聚合酶結(jié)合位點2.基因表達載體的構(gòu)建過程2.基因表達載體的構(gòu)建過程（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_________。（2）用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）再加入適量___________，將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶切口DNA連接酶相同的黏性末端2.基因表達載體的構(gòu)建過程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同種【思考1】使用一種DNA限制酶進行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接11’22’122’1’22’1’1深度思考【思考2】如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切EcoRⅠEcoRⅠBglⅡ防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化深度思考①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。

表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)。②工具酶：限制酶、DNA連接酶兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少。④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。點撥提升2游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉(zhuǎn)錄并翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂而進行復制，導致子代細胞中不再含有目的基因。若將目的基因插入載體，由于載體可以在細胞內(nèi)復制，隨著細胞分裂，載體會帶著目的基因存在于每個子代細胞中。這樣，基因工程才有意義。載體上的標記基因一般是某種抗生素的抗性基因，而受體細胞沒有抵抗該抗生素的能力。將含有某抗生素抗性基因的載體導入受體細胞，抗性基因在受體細胞內(nèi)表達，受體細胞對該抗生素產(chǎn)生抗性。在含有該抗生素的培養(yǎng)基上，能夠生存的是被導入了載體的受體細胞。點撥提升3:重組載體的篩選藍色菌落舍掉，白色菌落有的是需要的菌落，有的并不是所需菌落，所以后續(xù)一般還需要PCR等方式確認。1.如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制酶。下列說法錯誤的是(

)A．圖示對質(zhì)粒和目的基因切割用到了兩種限制酶B．抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來C．構(gòu)建基因表達載體時需要用到限制酶SmaⅠD．除圖示組成外，表達載體中還應該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)C學以致用22.方法：將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（最多）花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞（Ca+處理）1.轉(zhuǎn)化：目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程穩(wěn)定表達受體細胞第三步：將目的基因（重組質(zhì)粒）導入受體細胞探究要求：思考有關(guān)轉(zhuǎn)化的相關(guān)問題，小組合作交流，派代表展示成果，時間3min。合作交流Ca2+轉(zhuǎn)化法（導入微生物）使用Ca2+處理可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（感受態(tài)細胞）過程微生物作為受體細胞的優(yōu)點：繁殖快，單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)操作Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA分子操作程序：取受精卵顯微注射胚胎移植為什么常選用受精卵作為受體細胞呢？提純基因表達載體①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。顯微注射法（導入動物細胞）病毒介導法（主要用于導入動物細胞）

科學家也用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對S蛋白的免疫記憶?；ǚ酃芡ǖ婪ǎㄎ覈殑?chuàng)）②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；適用生物：開花植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有的

Ti質(zhì)粒上的

T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且將其整合到該受體細胞染色體DNA上兩次拼接兩次轉(zhuǎn)化①轉(zhuǎn)基因植物用

；②轉(zhuǎn)基因動物用

(一般不能用體細胞)；

原因是：

。③微生物常用

等。微生物作為受體細胞的優(yōu)點是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等則受體細胞為

原因是

；⑤一定不能用哺乳動物成熟的紅細胞，原因是

。真核細胞分泌蛋白等需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等的加工受精卵有發(fā)育的全能性無核，無器，不能合成蛋白質(zhì)體細胞(葉、芽、根)或受精卵受精卵大腸桿菌、酵母菌繁殖快，單細胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)操作知識小結(jié)：受體細胞的選擇點撥提升4或受精卵基因槍技術(shù):又被稱為生物彈道技術(shù)或微粒轟擊技術(shù),是用火藥爆炸或者高壓氣體加速將包裹了DNA的球狀金粉或者鎢粉顆粒直接送入完整的組織或者細胞中的一種技術(shù)。它是基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中的一種方法。其基本原理就是采用一種微粒加速裝置,使裹著外源基因的微米級的金或鎢(它們比重大,而且化學性質(zhì)都很穩(wěn)定)顆粒獲得足夠的動量打入靶細胞或組織。1.在將目的基因?qū)胧荏w細胞的相關(guān)操作中，敘述正確的是(

)A.導入植物細胞時均采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法B.轉(zhuǎn)基因動物的獲得多數(shù)運用基因槍法C.大腸桿菌作為受體細胞時通常需要使用Ca2＋處理D.導入目的基因的動物受精卵在培養(yǎng)液中發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物C學以致用3思考按前面三個步驟進行了操作，1.是否可以確定目的基因進入了受體細胞并能維持穩(wěn)定？2.是否可以確定目的基因一定能夠進行表達？3.是否可以確定得到了新的性狀？不一定！如何判斷？（分子探針與DNA雜交后顯示出來）（分子探針與mRNA雜交后顯示出來）第四步：目的基因的檢測與鑒定（1）定義：（2）特點：①應是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理成單鏈。②應帶有容易被檢測的標記。它可以包括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)而來的RNA。（3）核酸雜交：可以用于檢測目的基因：將待測DNA與目的基因探針混合，如果發(fā)生了核酸雜交，則說明有目的基因。是一段帶有檢測標記（熒光或同位素標記），且順序已知的，與目的基因能互補的核酸序列（DNA或RNA）?；パa的兩條核酸單鏈通過復性形成雙鏈的過程。知識拓展：基因探針①.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR擴增DNA半保留復制原理：基本思路：1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標記的DNA片段（基因探針），并用PCR擴增；2.提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；3.高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。方法2：DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對原理：第四步：目的基因的檢測與鑒定②.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術(shù)