第08講基因工程的基本操作程序

【學(xué)習(xí)目標(biāo)】

第

【基礎(chǔ)知識】

一、目的基因的篩選和獲取

1.篩選合適的目的基因：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一，如Bt

基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的I的基因。

2.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

（1）獲取目的基因的方法a.平合成（基因堿基序列是已知的）

b.PCR技術(shù)擴(kuò)增（已知基因兩側(cè)的堿基序列）

c.從基因文庫中獲?。ㄔ松铮?/p>

（2）PCR技術(shù)

PCR的含義：是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理在體外提供參與DNA復(fù)制

的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核昔酸序列進(jìn)行大量兔制的技術(shù)。

基本條件,所：需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，其中一般要添加Mg2+

一模板：已知兩側(cè)堿基序列的DNA母鏈

原料：4種脫氧核甘酸

K：耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）

引物：是2種與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸

反應(yīng)過程變性：加熱超過90℃,雙鏈DNA解旋為單鏈

復(fù)性：溫度下降至5（）℃左右，兩種引物與互補(bǔ)單鏈DNA結(jié)合

延伸：溫度上升到72℃左右，四種脫氧核甘酸在耐高溫的DNA聚合酶作用下合成子鏈DNA

結(jié)果：兩引物間固定長度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增（即2"）

鑒定PCR產(chǎn)物：用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定

注：1.含脫氧核甘酸鏈等長的DNA分子數(shù)為2n-2n

2.第三輪出現(xiàn)兩條鏈等長的DNA片段

3.兩種引物之間需要滿足的是：不能堿基互補(bǔ)配對，是防止引物之間結(jié)合形成雙鏈，降低引物與DNA

模板鏈結(jié)合的效率。

歸納總結(jié)

1、蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（BI抗蟲蛋白）為什么對人畜無害的原因：

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲揚(yáng)道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞

也沒有特異性受體，不能穿透細(xì)胞膜殺死細(xì)胞。

2、基因文庫的概念：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個(gè)受體菌

分別含有這種生物的不同基因，成為基因文庫。

3、cDNA概念：以mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄形成的DNA

6、cDNA文庫和基因組文庫的比較：

文庫類型cDNA文庫基因組文庫

文庫大小小大

基因中啟動子無有

基因中內(nèi)含子無有

基因多少某種基因的部分基因某種生物的全部基因

7、獲取目的基因的三種方法：①人工合成獲??；②從基因文庫獲取；③通過PCR技術(shù)獲取

8、PCR技術(shù)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留好制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制

的各種組分和反應(yīng)條件，對目的基因的核昔酸進(jìn)行大量亞制的技術(shù)。

9、引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。①體內(nèi)復(fù)制的引物為RNA單鏈;

②體外復(fù)制的引物一般為DNA單鏈

10、PCR反應(yīng)的條件：需要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行，需提供模板、引物、脫氧核昔酸、耐高溫的DNA聚

合酶（Taq酶）；同時(shí)需要控制溫度

11、運(yùn)用PCR技術(shù)時(shí)，緩沖液中需要加入一定的反虺，激活DNA聚合酶

10、DNA體內(nèi)復(fù)制的條件:

參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板

4種脫氧核甘酸合成DNA子鏈的原料

解旋酶打開DNA雙鏈

DNA聚合酶催化合成DNA子錐

引物使DNA聚合醯能夠從引物的3'端開始連接脫氧核甘酸

11、DNA體外更制（PCR）的條件

參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板

4種脫氧核甘酸合成DNA子鏈的原料

引物］

使DNA聚合酶能夠從引物的3,端開始連接脫氧核甘酸

90℃以上高溫打開DNA雙鏈（變性溫度）

耐高溫的DNA聚合酶催化合成DNA子鏈

緩沖液（含Mg2+）激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶

不同的溫度變性、復(fù)性和延伸需要不同的溫度

12、PCR擴(kuò)增的過程:

名稱具體內(nèi)容

變性目的基因DNA受熱變性后形成單鏈

復(fù)性（退火）引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合

以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酹將溶液中四種脫氧核甘酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對

延伸

原則合成新的子鏈

13、PCR擴(kuò)增的結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，計(jì)算公式：2：,其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)

14、擴(kuò)增循環(huán)n次所需要的引物：計(jì)算公式：2^'-2,至少需要經(jīng)過3次擴(kuò)增以后才能得到目的基因，且擴(kuò)

增第3次后能得到2個(gè)目的基因

15、PCR產(chǎn)物鑒定方法：采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物

二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

1.構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的a.q目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代

h使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用

2.基因表達(dá)載體的構(gòu)成：FI的基因+標(biāo)記基因+啟動子+終止子

啟動子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，

軀動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA,有時(shí)為了滿足應(yīng)用需要，會在載體中人工構(gòu)建誘導(dǎo)型啟動

子，當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，可以激活或抑制目的基因的表達(dá)。

終止子：也位于DNA上在基因的下游，終止轉(zhuǎn)錄

起始密碼子和終止密碼子：位于mRNA上，決定翻譯的開始和結(jié)束

再利用DNA通接.科目R雄皿方——

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程（P80-圖3-6）年川被8T—個(gè)重但DNA分子（圖3-6）.

（1）首先用一定的限制酶切割載體

（2）然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶

切割含目的基因的DNA片段

（3）再利用DNA連接酶將含目的基因的DNA片段

拼接到載體的切口處

注意：選擇限制酶的三大原則一大要求（題干特定要求）

標(biāo)記基因PstI

PstISmaIPstI

EcoRI

slaI抗病;因‘JRI

甲乙

（l）不能破壞目的基因如圖甲，可選擇PstI而不選擇SmaI

-（2）不能破壞質(zhì)粒中的重要元件（如復(fù)制原點(diǎn).啟動子.終止子.標(biāo)記基因（至少保留一個(gè)））

（3）質(zhì)粒與目的基因形成相同的黏性末端（?般使用雙酶切，比點(diǎn)是可以防止質(zhì)粒和目的基因的自身

環(huán)化以及目的基因與載體的反向連接）

歸納總結(jié)

1.基因表達(dá)載體的功能：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，使目的基因能夠復(fù)制

和發(fā)揮作用

2.表達(dá)載體的組成：①復(fù)制原點(diǎn)；②目的基因；③標(biāo)記基因；④啟動子；終止子（諧音記憶：一元買兩雞子）

3.扇動子：位于基因的上游?段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶以別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動

基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的mRNA。

4.終止子：位于基因的下游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，終止轉(zhuǎn)錄

5.啟動子與起始密碼子、終止子與終止密碼子的區(qū)分：

項(xiàng)目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子

位置基因的上游基因的下游mRNA上mRNA上

化學(xué)本質(zhì)DNA序列DNA序列RNA序列RNA序列

RNA聚合酶識別和結(jié)

終止基因蛋白質(zhì)合成開始的終止蛋白質(zhì)合成

作用合的部位，啟動基因的

的轉(zhuǎn)錄信號（起點(diǎn)）（終點(diǎn)）

轉(zhuǎn)錄

6.構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)只能用同?種限制酶切割目的基因和載體嗎？

不是，切割忖的基因和載體并非只能用同一種限制酶，如果兩種不同的限制酶切割后形成的黏性末端

相同，在DNA連接酶的作用下目的基因和載體也可以連接起來。

三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

1.轉(zhuǎn)化的概念（重點(diǎn)）：目的基區(qū)進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

2.常用的轉(zhuǎn)化方法

導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)產(chǎn)菌轉(zhuǎn)化法（最常用）受體是體細(xì)胞或受精卵

花粉管通道法（我國獨(dú)創(chuàng)）如抗蟲棉

導(dǎo)入動物細(xì)胞：最常用的方法是顯微注射技術(shù)受體細(xì)胞多是受精卵

導(dǎo)入微生物細(xì)胞：常以大腸桿菌作為受體細(xì)胞

一般先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（即感受態(tài)），

然后再將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中。

3.重組細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞后，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)

農(nóng)桿菌的特點(diǎn)：農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）

轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。

歸納總結(jié)

1.轉(zhuǎn)化的概念：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。

2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：

生物類型方法受體細(xì)胞過程特點(diǎn)

植物受粉一段時(shí)間后剪去

柱頭-＞滴加DNA溶液（含目

花粉管通道我國獨(dú)創(chuàng)的一

轉(zhuǎn)基因植物受精卵的基因）一目的基因借助花

法種方法

粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞（胚

囊）一目的基因表達(dá)

將目的基因插入到農(nóng)桿菌Ti

質(zhì)粒的T-DNA片段上t

適用于雙子葉

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體細(xì)胞或轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌一用農(nóng)桿菌侵

轉(zhuǎn)基因植物植物和裸子植

法受精卵染植物細(xì)胞一目的基因整

物

合到植物細(xì)胞染色體DNA

上一目的基因表達(dá)

提純含目的基因的表達(dá)載

目的基因?qū)?/p>

體T取卵（受精卵顯微注

轉(zhuǎn)基因動物顯微注射法受精卵動物細(xì)胞最有

射一胚胎早期發(fā)育，移植一

效的方法

獲得具有新性狀的動物

用Ca2+處理微生物細(xì)胞一＞

處于能吸收DNA分子的狀

Ca2+處理微生物態(tài)（即感受態(tài)細(xì)胞）一基因表簡便、經(jīng)濟(jì)、有

轉(zhuǎn)基因微生物

法細(xì)胞達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合效

一在一定溫度下促進(jìn)感受

態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子

四、目的基因的表達(dá)與檢測

1.分子水平的檢測1）］通過PCR等技術(shù)檢測受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因

2）利用PCR技術(shù)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA

3）用相應(yīng)抗體進(jìn)行抗原一抗體雜交檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)等

2.個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定：抗蟲.抗病接種試驗(yàn)等

總結(jié)-基因工程的基本操作流程（P82-圖3-7）

獲取質(zhì)粒、噬,用限制酶切割裁體、，

菌體等載體和含有目的基因的

DNA片段，然后用

篩選和獲取目DNA連接酶連接，

的基因構(gòu)建基因表達(dá)載"

A佟|3-7基因工程的基本操作流程圖

歸納總結(jié)

類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示

分子水平目的基因是否插入受體細(xì)胞是否擴(kuò)增出目的

PCR技術(shù)

的檢測DNA上基因

目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNAPCR技術(shù)

抗原一抗體雜交（蛋白質(zhì)是否顯示出雜交

目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)

和蛋白質(zhì)之間）帶

個(gè)體生物學(xué)水對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行抗性是否賦予了預(yù)期

是否具有抗性及抗性程度

平的檢測接種實(shí)驗(yàn)抗性

五、DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定

實(shí)驗(yàn)原理：

LDNA片段的擴(kuò)增：PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解旋與結(jié)合。

2.瓊脂糖凝膠電泳P54

（1）帶電粒子：DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基因可以帶上正電荷或負(fù)電荷。

（2）電泳：在電場的作用下，帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個(gè)過程就是電泳。

（3）遷移速率：在凝膠中DNA分了?的遷移速率與凝膠的濃度.DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)。

（4）檢測：凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈卜.被檢測出來

3.操作提示P85注意

（1）為避免外源DNA等因素的污染，PCR試驗(yàn)中使用的微量離心管.槍頭和蒸儲水等在使用前必須進(jìn)行高

壓滅菌處理。

（2）緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20C儲存。使用前所需試劑從冰箱拿出放在冰塊上緩慢融化。

（3）添加反應(yīng)組分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。

（4）在進(jìn)行操作時(shí)，一定要戴好一次性手套。

4.結(jié)果分析與評價(jià)

（1）未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的原因

a.TuqDNA聚合隨失活b.引物出現(xiàn)質(zhì)量問題c.Mg2+濃度過低d.變性時(shí)的溫度低，變性時(shí)間短

（2）出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶的主要原因

a.模板DNA出現(xiàn)污染b.引物特異性不強(qiáng)（過短）或形成引物二聚體c.Mg2+濃度過高

d.復(fù)性時(shí)的溫度過高

附圖：

GATCCTT……目的?CC

~GAA……A因???GqCTAG

3AlycG「??,AATTG

TAGC-i-TTAACCTAG

-AATTG^ATCCTT-HW-CCGATCATCG...

-TTAACCTAGGAA從因??GgCTAjjTAGC-S

?AATTG9V1399?&m……VV9GATCATCG-

??TTAACCTAGb"MU??…口331)*6＜：…

「看【考點(diǎn)剖析】

考點(diǎn)一：目的基因的篩選與獲取

F例

I.2020年3月16□,中國科學(xué)家陳薇院士團(tuán)隊(duì)研制的重組新冠疫苗通過臨床研究注冊審評，獲

批進(jìn)入臨床試驗(yàn)。重組新冠疫苗的制備流程如圖?；卮鹣铝袉栴}。

(1)步驟②需要作為原料。步驟③需要的工具酶主要是

（2）被用作載體的Ad5應(yīng)具有的特點(diǎn)是（答出1點(diǎn)即可）。

（3）步驟④是o

（4）重組疫苗注入志愿者體內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白作為,刺激機(jī)體產(chǎn)生能與之相結(jié)合

的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標(biāo)。參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿足的條件

之一是（填“有”或"無"）SARS-CoV-2感染史，理由

是____________________________________________________________________________

（5）為探究疫苗的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果，需進(jìn)一步試驗(yàn)，請寫出試驗(yàn)思路：

【答案】（1）脫氧核甘酸〃同酶（2）能自我復(fù)制（或有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因位點(diǎn)、對

受體細(xì)胞無害）（3）基因表達(dá)載體的構(gòu)建（4）抗原無有SARS-CoV-2感染史的志愿者皿清中存在一

定量的相應(yīng)抗體，會對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾（5）給不同組志愿者分別注射不同劑量的疫苗，一段時(shí)間后采集

血樣并檢測相應(yīng)抗體的水平

【解析】（1）步驟②為逆轉(zhuǎn)錄過程，合成的產(chǎn)物是cDNA,因此需要脫氧核甘酸作為原料。步驟③為利用PCR

技術(shù)擴(kuò)增獲得S蛋白基因的過程，該過程需要的酶是hg酶（耐高溫的DNA聚合酶）。（2）Ad5作為載體應(yīng)具

有的特點(diǎn)是能自我復(fù)制、有多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)、有標(biāo)記基因、在宿主細(xì)胞中可以存活并表達(dá)、對宿主細(xì)

胞無害等。（3）步驟④為構(gòu)建目的基因表達(dá)載體的過程，即重組新冠疫苗的過程。（4）重組疫苗注入志愿者體

內(nèi)后，S蛋白基因指導(dǎo)合成的S蛋白可作為抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫過程，使機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生能與

之相結(jié)合的抗體，抗體的分泌量可作為檢測疫苗對志愿者免疫效果的指標(biāo).參加臨床試驗(yàn)的志愿者需要滿

足無SARS-CoV-2感染史的條件，即未感染過新冠病毒的志愿者，因?yàn)楦腥具^新冠病毒的人體內(nèi)含有相

應(yīng)的記憶細(xì)胞，若注射疫苗，則會出現(xiàn)二次免疫的特征，即體內(nèi)的記憶細(xì)胞會迅速增殖分化，產(chǎn)生大量的

漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成并分泌大量的抗體，從而導(dǎo)致無法檢測出該疫苗的真正效果。（5）實(shí)驗(yàn)H的為探究疫苗

的注射劑量對志愿者產(chǎn)生的免疫效果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目芍搶?shí)驗(yàn)的自變量為疫苗的注射劑量，因變量為

抗體產(chǎn)生量，因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如F：將同性別且年齡相當(dāng)?shù)闹驹刚唠S機(jī)分成若干組，然后給不同組別的志愿

者注射不同劑量的疫苗，一段時(shí)間之后，檢測志愿者體內(nèi)的抗體產(chǎn)生量，作好記錄并進(jìn)行比較、分析，從

而得出結(jié)論。

考點(diǎn)二：表達(dá)載體的構(gòu)建

、"例2.大腸桿菌p-半乳糖甘酶（Z酶）可催化底物（X-gal）水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。在pUC18質(zhì)粒中，/acZ編

碼Z酶氨基端的一個(gè)片段（稱為a-肽），該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及限制酶識別位點(diǎn)如圖甲所示。已知a-肽、缺失a-肽的Z

酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無Z酶活性，共同存在時(shí)就會表現(xiàn)出Z酶活性。利用圖乙中的DNA片段與pUC18質(zhì)

粒進(jìn)行基因工程操作。

Sal1H/ndinSalI

.1.1.1.

門

1IJ、*—J

目的基因

乙

⑴限制酶能催化雙鏈DNA分子中(填化學(xué)鍵名稱)的斷裂。本實(shí)驗(yàn)可使用限制酶處理

pUC18質(zhì)粒和圖乙中的DNA片段，再通過DNA連接的連接，獲得含目的基因的重組質(zhì)粒。

(2)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后將大腸桿菌接種到含氨葦青霉素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，由「未發(fā)生

轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有，在該培養(yǎng)基上不能生長。從功能上劃分，該培養(yǎng)基屬

于培養(yǎng)基。

(3)當(dāng)上述培養(yǎng)基中含有X-gal時(shí)，生長出的菌落有藍(lán)色和白色兩種類型，其中含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌的

菌落顏色為，這是因?yàn)開__________________________________

為保證能通過菌落顏色辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)作為受體細(xì)胞的大腸桿菌中Z酶基因應(yīng)滿

足的條件是。

【答案】⑴磷酸二酯鍵Sall

(2)氮葦青霉素抗性選擇

(3)白色目的基因與質(zhì)粒連接后使hcZ'被破壞，不能合成a-肽編碼a-肽的DNA序列缺失，其他序列正

常

【解析】⑴限制酶能催化雙鏈DNA分子中特定部位磷酸二酯鍵的斷裂，將DNA斷開。從圖中可知，酶

可破壞目的基因，而質(zhì)粒和目的基因兩側(cè)都有隨SHI識別位點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)可使用限制酹Sall處

理pUCI8質(zhì)粒和圖乙中的DNA片段。

(2)重組質(zhì)粒上有氨年青霉素抗性基因，由于未發(fā)生轉(zhuǎn)化的大腸桿菌沒有該質(zhì)粒，因而不具有氨節(jié)青霉素抗

性，在含氨葦青霉素培養(yǎng)基上不能生長。從功能上劃分，該培養(yǎng)基屬于選擇培養(yǎng)基，選擇了含重組質(zhì)粒的

大腸桿菌。

(3)從圖中可知，重組質(zhì)粒是用酶Sa/1分別處理過的質(zhì)粒和目的基因片段形成的，重組質(zhì)粒的/acZ基因被

破壞，不能合成P-半乳糖甘酷億能)，不能催化底物(X-gal)水解產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，故呈菌落白色,已知a-肽、

缺失a-肽的Z酶片段單獨(dú)存在時(shí)均無Z酶活性，共同存在時(shí)就會表現(xiàn)出Z酶活性，為保證能通過菌落顏色

辨別出含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，本實(shí)驗(yàn)作為受體細(xì)胞的大腸桿菌中Z酶基因應(yīng)滿足的條件是編碼a-肽的

DNA序列缺失，其他序列正常。

考點(diǎn)三、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

由例

3.乙烯具有促進(jìn)果實(shí)成熟的作用，ACC氧化施和ACC合成酶是番茄細(xì)胞內(nèi)合成乙烯的兩個(gè)關(guān)鍵

酷。利用反義基因技術(shù)（原理如圖1）,可以抑制這兩個(gè)基因的表達(dá)，從而使番茄具有耐儲存、宜運(yùn)輸?shù)膬?yōu)點(diǎn)。

圖2為融合ACC氧化酶基因和ACC合成的基因的反義基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。

細(xì)胞原有基因

（靶基因）

DNA

不能合

靶mRNA~一成基因

反義RNAX7的蛋白

形成互補(bǔ)雙鏈RNA,產(chǎn)物

反義基因不能與核糖體結(jié)合或

被RNA醒降解

圖1反義基因技術(shù)

復(fù)制原點(diǎn)

圖2反義基因表達(dá)載體

⑴圖2中的2Ali為特異性啟動子，則2Ali應(yīng)在番茄的（填器官名稱）中表達(dá)。

（2）從番茄成熟果實(shí)中提取作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，對

它們進(jìn)行拼接構(gòu)成融合基因并擴(kuò)增。

⑶合成出的ACC氧化酹基因兩端分別含限制酶反〃用I和X/構(gòu)I的酶切位點(diǎn),ACC合成陋基因兩端含Sac1

和XbaI的酶切位點(diǎn)，用限制隨對上述兩個(gè)基因進(jìn)行切割后，再將它們拼接成融合基因，相應(yīng)的

Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶進(jìn)行切割，以確保融合基因能夠插入載體中。

（4）為了實(shí)現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因（填“正向”或“反向”）插入啟動子2Ali的下游即

可構(gòu)成反義融合基因。

⑸在檢測番茄細(xì)胞中是否存在反義融合基因時(shí)，（虞?能"或"不能"）用放射性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化

（合成）酶基因片段作探針進(jìn)行檢測，理由

是O

【答案】⑴果實(shí)（2）RNA（3）XhaI及〃”HI和Sac【（4）反向（5）不能番茄細(xì)胞內(nèi)本來就存在ACC

氧化（合成）陋基因，能與ACC氧化（合成）睡基因探針發(fā)生分子雜交

【解析】（1）番茄食用的是果實(shí)，因此，啟動子2Ali應(yīng)在番茄的果實(shí)中表達(dá)。（2）從番茄成熟果實(shí)中提取RNA

作為模板，利用反轉(zhuǎn)錄法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因。（3）使用限制酶X/%I對合成出的ACC

氧化酶基因和ACC合成酶基因進(jìn)行切割后，兩種基因有相同的黏性末端，可將二者拼接形成融合基因。相

應(yīng)的Ti質(zhì)粒和融合基因均使用限制酶I和SacI進(jìn)行切割，然后再連接，可以確保融合基因能夠插

入載體中。（4）為了實(shí)現(xiàn)圖1中反義基因的效果，應(yīng)將融合基因反向插入啟動子2Ali的下游。（5）番茄細(xì)胞

內(nèi)本來就存在ACC氧化（合成）酶基因，能與ACC氧化（合成）醐基因探針發(fā)生分子雜交，因此，不能用放射

性物質(zhì)標(biāo)記的ACC氧化（合成）陋基因作為探針進(jìn)行檢測。

四、目的基因的檢測與鑒定

例4.通過把編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因定向插入酵母菌細(xì)胞中，使之充分表達(dá)，再經(jīng)純化

可制得乙型肝炎疫苗?；卮鹣铝袉栴}：

（1）人體接種乙型肝炎疫苗后，該疫苗可作為刺激機(jī)體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗先后需

要接種多次，其目的是o

（2）如果已知乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列，則可以推測出相應(yīng)目的基因的核甘酸序列，但推測出的

目的基因核甘酸序列并不是唯一的，其原因是。

（3）洛編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞之前需要構(gòu)建基因表達(dá)載體，這一過程中需要的工

具醉主要有。構(gòu)建的基因表達(dá)載體口，編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因應(yīng)該

位于之間。

（4）洛編碼乙型肝炎病毒表面抗原的基因?qū)虢湍妇?xì)胞時(shí)，使該基因在酵母菌細(xì)胞中得以穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵

是o

【答案】（1）抗原使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞（2）決定氨基酸的密碼子具有簡并性（或決定一種家

基酸的密碼子往往不是只有一種）（3）限制酶和DNA連接酶啟動子和終止子（4）確保編碼乙型肝炎病毒

表面抗原的基因插入到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上

【解析】（1）乙型肝炎疫苗可作為抗原引起人體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。乙型肝炎疫苗需先后接種多次的目的

是使人體產(chǎn)生更多的抗體和記憶細(xì)胞，以發(fā)揮最大的免疫效果。（2）由于mRNA上的密碼子具有簡并性，根

據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列推測出的mRNA的核甘酸序列不是唯一的，所以推測出的基因的核甘酸序列不是唯

一的。（3）在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，需要用限制酶切割H的基因片段與載體，再用DNA連接酶把目的基

因與載體連接起來。構(gòu)建的基因表達(dá)載體中，啟動了?和終止子分別是基因表達(dá)中轉(zhuǎn)錄起始和終止的調(diào)控序

列，目的基因需要插在啟動子和終止子之間。（4）真核細(xì)胞分裂時(shí)細(xì)胞質(zhì)DNA隨機(jī)分配，應(yīng)將目的基因插入

到酵母菌細(xì)胞的染色體DNA上，以確保目的基因在酵母菌細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。

【真題演練】

I.（2021湖北,16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除付的基因條帶（引物與模板完全配

對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中

有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延長熱變性的時(shí)間

C.延長延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度

【答案】D

【解析】

【分析】多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，PCR過程一般經(jīng)歷下述三循環(huán)：

952F使模板DNA變性、解鏈-55c下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）一＞72c下引物鏈延伸（形成新的

脫氧核甘酸鏈）。

【詳解】A、增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤：

BC、延長熱變性的時(shí)間和延長延伸的時(shí)間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有

效減少反應(yīng)非特異性條帶，BC錯誤；

D、非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過低會造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通過提高復(fù)性的

溫度來減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。

2.（2020北京生物高考題）12.為了對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)

運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中（如圖）。

坪界楊樹內(nèi)源DNA

（注：①、②、③、④表示引物）

為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行PCR

擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）

A.①+③B.①+@C.③+②D.③+④

【答案】B

【解析】圖示中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中，若要檢

測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子序列和

HMA3基因序列，應(yīng)選擇的引物組合是①+②，即B正確，ACD錯誤。

3.12021湖北，16）某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶（引物與模板完全

配對）外，還有2條非特異條帶（引物和模板不完全配對）。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施

中有效的是（）

A.增加模板DNA量B.延長熱變性的時(shí)間

C.延長延伸的時(shí)間D.提高復(fù)性的溫度

【答案】D

【解析】增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少非特異性條帶，A錯誤；延長熱變性的時(shí)

間和延長延伸的時(shí)間會影響變性延伸過程，但對于延伸中的配對影響不大，故不能有效減少反應(yīng)非特異性

條帶，BC錯誤：非特異性產(chǎn)物增加的原因可能是復(fù)性溫度過低會造成引物與模板的結(jié)合位點(diǎn)增加，故可通

過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異性條帶的產(chǎn)生，D正確。

4.（2020?北京）為了對重金屬污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)，研究者將從楊樹中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）

基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)人楊樹基因組中（如圖）.

左邊屈T>右邊界

?M內(nèi)內(nèi)?DNA

—Ha動手HHMQ茶因H終止于H—

（注：①、②、③、④表示引物）

為檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因，同時(shí)避免內(nèi)源HMA3基因的干擾，在進(jìn)行

PCR擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)選擇的引物組合是（）

A.①+③B.①+②C.③+②D.③+④

【答案】B

【解析】圖示中克隆的重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMA3）基因與外源高效啟動子連接，導(dǎo)入楊樹基因組中，若

要檢測獲得的轉(zhuǎn)基因楊樹苗中是否含有導(dǎo)入的HMA3基因和高效啟動子，需要檢測是否含有高效啟動子

序列和HMA3基因序列，應(yīng)選擇的引物組合是①+②，即B正確，ACD錯誤。

5.12019?北京）篩選淀粉分解菌需使用以淀粉為唯一碳源的培養(yǎng)基。接種培養(yǎng)后，若細(xì)菌能分解淀粉，培

養(yǎng)平板經(jīng)稀碘液處理，會出現(xiàn)以菌落為中心的透明圈（如圖），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表。

菌種菌落直徑：C（mm）透明圈直徑：H（mm）H/C

細(xì)菌I5.111.22.2

細(xì)菌II8.113.01.6

有關(guān)本實(shí)驗(yàn)的敘述，錯誤的是（）

A.培養(yǎng)基除淀粉外還含有氮源等其他營養(yǎng)物質(zhì)

B.篩選分解淀粉的細(xì)菌時(shí)，菌液應(yīng)稀釋后涂布

C.以上兩種細(xì)菌均不能將淀粉酶分泌至細(xì)胞外

D.H/C值反映了兩種細(xì)菌分解淀粉能力的差異

【答案】C

【解析】篩選淀粉分解菌的培養(yǎng)基中，除淀粉提供碳源外，還需要氮源、水、無機(jī)鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，A正

確；篩選分離淀粉分解菌時(shí)需要將菌液進(jìn)行一定程度的稀釋才能涂布培養(yǎng)，B正確；據(jù)圖分析可知，兩

個(gè)菌落均產(chǎn)生了透明圈，說明兩種細(xì)菌均能將淀粉酶分泌至細(xì)胞外，C錯誤；據(jù)表分析可知，H/C值越

大，分解淀粉能力越強(qiáng)，該值的大小反映了兩種細(xì)菌分解淀粉能力的差異，D正確。

6.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1）,擬將其與質(zhì)粒（圖

2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ?/p>

EroRIEroRI

ICC因|

圖1

A.用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒

B.用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞

C.在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞

D.用分子雜交方法檢測C基因是否整合到菊花染色體上

【答案】C

【解析】據(jù)圖分析可知，在目的基因的兩端、啟動子和終止了之間都有限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI的切割

位點(diǎn)，因此可以用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR【切割目的基因和運(yùn)載體，之后再用DNA連接酶連接形成基

因表達(dá)載體，A正確；將目的基因?qū)氲街参锛?xì)胞，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，可以將目的基因C導(dǎo)入到農(nóng)桿

菌的Ti質(zhì)粒的T-DNA段，之后再用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞中染色

體上的DNA上，B正確；圖2中顯示標(biāo)記基因是潮霉素抗性基因，應(yīng)該在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被

轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，C錯誤；要檢測轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是采用分子雜交

技術(shù)，D正確。

7.（2021?北京）新冠病毒（SARS-CoV-2）引起的疫情仍在一些國家和地區(qū)肆虐，接種疫苜是控制全球

疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多種，其中我國科學(xué)家已研發(fā)出的腺病毒載體重組新冠病毒疫苗（重

組疫苗）是一種基因工程疫苗，其基本制備步驟是：將新冠病毒的S基因連接到位于載體上的腺病毒基因

組DNA中，重組載體經(jīng)擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入特定動物細(xì)胞，進(jìn)而獲得重組腺病毒并制成疫苗。

（1）新冠病毒是RNA病毒，一般先通過得到cDNA,經(jīng)獲取S基因，悔切后再連接

到載體。

（2）重組疫苗中的S基因應(yīng)編碼—o

A.病毒與細(xì)胞識別的蛋白

B.與病毒核酸結(jié)合的蛋白

C.催化病毒核酸復(fù)制的酶

D.幫助病毒組裝的蛋白

（3）為保證安全性，制備重組疫苗時(shí)刪除了腺病毒的某些基因，使其在人體中無法增殖，但重組疫苗仍然

可以誘發(fā)人體產(chǎn)生針對新冠病毒的特異性免疫應(yīng)答。該疫苗發(fā)揮作用的過程是：接種疫苗—-—-—

誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)。

（4）重組疫苗只需注射一針即可完成接種。數(shù)周后，接種者體內(nèi)仍然能檢測到重組腺病毒DNA,但其DNA

不會整合到人的基因組中。靖由此推測只需注射一針即可起到免疫保護(hù)作用的原因。

【答案】（I）逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增（2）A

（3）（重組腺病毒）進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)抗原

（4）重組腺病毒DNA在人體細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)抗原，反復(fù)刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)

【解析】⑴新冠病毒是RNA病毒，其遺傳物質(zhì)是RNA,若要得到與其對應(yīng)的cDNA,則要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)

錄。用cDNA擴(kuò)增出目的基因一S基因需要利用PCR擴(kuò)增技術(shù)。

（2）重組疫苗作為抗原需要被人體免疫系統(tǒng)以別，而重組疫苗中的S基因是從新冠病毒中提取的，所以

重組疫苗中的S基因應(yīng)編碼病毒與細(xì)胞都能識別的蛋白，A正確，BCD錯誤。

故選Ao

（3）重組疫苗對人體來說屬于外來異物，即抗原，故人體接種疫苗后，重組腺病毒進(jìn)入人體細(xì)胞，其在

人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出抗原，引發(fā)嘰體產(chǎn)生特異性免疫--細(xì)胞免疫和體液免疫，因此該疫苗發(fā)揮作用的過

程是：接種疫苗-（重組腺病毒）進(jìn)入細(xì)胞T表達(dá)抗原T誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)。

（4）接種疫苗后，由于長時(shí)間內(nèi)接種者體內(nèi)仍能檢測到重組腺病毒DNA,而DNA會不斷表達(dá)出S蛋

白，S蛋白作為抗原刺激機(jī)體，故機(jī)體會反復(fù)針對抗原產(chǎn)生.特異性免疫應(yīng)答。

8.[2019?北京）光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，發(fā)生在高等植物、藻類和光合細(xì)菌中。

（1）地球上生命活動所需的能量主要來源于光反應(yīng)吸收的—.在碳（暗）反應(yīng)中，RuBP粉化酶（R酶）

催化CO?與RuBP（C5）結(jié)合，生成2分子C3.影響該反應(yīng)的外部因素，除光照條件外還包括—（寫出

兩個(gè)）；內(nèi)部因素包括（寫出兩個(gè)）。

（2）R能由8個(gè)大亞基蛋白（L）和8個(gè)小亞基蛋白（S）組成。高等植物細(xì)胞中L由葉綠體基因編碼并在

葉綠體中合成，S由細(xì)胞核基因編碼并在—中由核糖體合成后進(jìn)入葉綠體，在葉綠體的一中與L組裝成

有功能的酶。

（3）研究發(fā)現(xiàn)，原核生物藍(lán)藻（藍(lán)細(xì)菌）R酶的活性高于高等植物。有人設(shè)想通過基因工程技術(shù)將藍(lán)藻R

酶的S、L基因轉(zhuǎn)入高等植物，以提高后者的光合作用效率。研究人員將藍(lán)藻S、L基因轉(zhuǎn)入某高等植物（甲）

的葉綠體DNA中，同時(shí)去除甲的L基因。轉(zhuǎn)基因植株能夠存活并生長。檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中的R

能活性高于未轉(zhuǎn)基因的正常植株.

①由上述實(shí)驗(yàn)?zāi)芊竦贸觥稗D(zhuǎn)基因植株中有活性的R酶是由藍(lán)藻的S、L組裝而成”的推測？請說明理

由。。

②基于上述實(shí)驗(yàn)，下列敘述中能夠體現(xiàn)生物統(tǒng)一性的選項(xiàng)包括—O

a.藍(lán)藻與甲都以DNA作為遺傳物質(zhì)

b.藍(lán)藻與甲都以R酶催化CO2的固定

c.藍(lán)藻R酶大亞基蛋白可在甲的葉綠體中介成

d.在藍(lán)藻與甲的葉肉細(xì)胞中R酹組裝的位置不同

【答案】（I）光能溫度、CO?濃度色素含量及種類、睡的含量及活性

（2）細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)基質(zhì)

（3）①不能，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植株仍包含甲植株的S基因，不能排除轉(zhuǎn)基因植株中R酶由藍(lán)藻的L蛋白和甲植

株的S蛋白組成

②a、b、c

【解析】1、光合作用的過程圖解:

2、基因工程技術(shù)的基本步驟:

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記

基因等。

（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方

法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞最有效的方法是顯微注射法：將

目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因-

-DNA分子雜交技術(shù)：②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)：③檢測目的基因是否翻譯

成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）地球上生命活動所需的能量主要來源于光反應(yīng)吸收的光能,在碳（暗）反應(yīng)中，RuBP援化酶（R酶）

催化CO?與RuBP（C5）結(jié)合，與成2分子C3.影響該反應(yīng)的外部因素，除光照條件外還包括溫度、C02

濃度等；內(nèi)部因素包括色素含量及種類、酶的含量及活性等。

（2）R酶由8個(gè)大亞基蛋白（L）和8個(gè)小亞基蛋白（S）組成。高等植物細(xì)胞中L由葉綠體基因編碼并在

葉綠體中合成，S由細(xì)胞核基因編碼并在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中由核糖體合成后進(jìn)入葉綠體，在葉綠體的中與L