1基于聚合酶基因序列的HIV-1耐藥突變分析技術(shù)規(guī)范核酸提取、基因擴(kuò)增、序列測定、耐藥分析、結(jié)果解釋、質(zhì)量控制以及生物安全本文件適用于全國各級各類開展基于聚合酶基因序列的人免疫缺陷病毒1型基因型耐藥檢測的實驗GB/T30989高通量基因測序技術(shù)GB/T34265Sanger法測序技術(shù)WS293艾滋病和艾滋病病毒感染診斷3.13.23.33.43.5基因型耐藥檢測genotypicdrugr通過分析HIV-1基因序列，確定其中是否存在導(dǎo)致耐藥3.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)reversetranscription-polymerasechainreaction;23.73.83.9高通量基因測序high-throughputg3.103.11對檢測過程的質(zhì)量進(jìn)行評估，以判斷其是否滿足預(yù)期的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或要3.12質(zhì)控品qualitycontrol3.13指基因序列中某個位點的堿基無法確定，可能是多個堿基中的一種。3.143.153.16指測序數(shù)據(jù)中,對質(zhì)量值為30的堿基識別準(zhǔn)確率為99.9%,或3.174縮略語HIV-1：人免疫缺陷病毒1型（humanimmunoPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaRT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscription-polymerasechainreacRT：逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptionpolym常用的樣本是血漿，也可使用血清、干血斑、全血或外5.2樣本采集、處理和保存按照WS293-2019和GB19489的規(guī)定執(zhí)行。應(yīng)避5.2.1血清采集靜脈血，使用促凝劑，分離血清，-705.2.2血漿5.2.3全血5.2.5干血斑6.1提取方法根據(jù)樣本和核酸類型，選擇適宜的方法提取和純化樣本中的病毒核酸，嚴(yán)格按照說明書操作。6.2低病毒載量血漿樣本的處理6.3質(zhì)量評估4可檢測核酸濃度和純度評估核酸質(zhì)量，能滿擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域一般應(yīng)包括蛋白酶區(qū)第10至第93位密碼子和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)第41至第238位密碼子，及整合酶區(qū)第51至第263位密碼子。根據(jù)擴(kuò)增片段兩端的堿基序列設(shè)計特異性引物?？蓞?.3擴(kuò)增體系和程序應(yīng)按照試劑盒說明書或?qū)嶒炇易越ǚ椒ǖ臉?biāo)準(zhǔn)操7,4質(zhì)量控制確認(rèn)擴(kuò)增片段大小。陽性對照擴(kuò)增出大小正確的目的片段、陰性對照無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明擴(kuò)增成功。8.1測序方法采用切膠純化或其他方法純化擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Sanger法對擴(kuò)增產(chǎn)物直8.2測序區(qū)域8.3序列質(zhì)量評價根據(jù)測序色譜圖評價測序質(zhì)量，合格的序列堿基峰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)≥20，且長度≥500b59.1.2高通量測序9.2耐藥突變判讀將拼接編輯好的序列提交給特定的HIV耐藥分析數(shù)據(jù)庫或者軟件，通過與參考序列比對，判讀耐藥9.3耐藥程度判讀通過HIV耐藥分析數(shù)據(jù)庫判斷突變對藥物耐受性的影響以及耐藥程度。參9.4結(jié)果復(fù)核9.4.1耐藥突變復(fù)核9.4.2耐藥程度復(fù)核10.2結(jié)果解釋611.2使用室內(nèi)質(zhì)控品制備含耐藥突變或不含耐藥突變的、不同病毒載量的陽性質(zhì)控品，以及不含HIV的陰性質(zhì)控品，與待測樣本同步檢測，根據(jù)質(zhì)控品的檢測結(jié)果，判斷檢測是否在控，對失控結(jié)果及時11.3能力驗證可定期參加省級及以上專業(yè)機(jī)構(gòu)組織的HIV耐藥檢測室間質(zhì)量評價HIV-1基因型耐藥檢測應(yīng)在市級衛(wèi)生主管部門備案的生物安7HIV-1pol基因區(qū)常用擴(kuò)增引物PR-RT基因PCR5,-TGAARGAITGYACTGARAGRCAGGCTAAT-3,5,-ACTGARAGRCAGGCTAATTTTTTAG-3,5,-TAGGGARAATYTGGCCTTCC-3,5,-ATCCCTGCATAAATCTGACTTGC-3,5,-CTTTARCTTCCCTCARATCACTCT-3,5,-CTTCTGTATGTCATTGACAGTCC-3,5,-AGTCCTATTGARACTGTRCCAG-3,5,-TACTAGGTATGGTAAATGCAGT-3,5,-TTTYTCTTCTGTCAATGGCCA-3,5,-CAGTACTGGATGTGGGRGAYG-3,注：適合HIV-1不同亞型毒株P(guān)R-RPR-RT基因5,-CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC-3,5,-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3,5,-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3,PCR5,-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3,RTAS-qian5,-GCCAACAGCCCCACCA-3,5,-GGACCTACACCTGTCAAC-3,5,-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3,5,-GCTGGGTGTGGTATTCC-3,5,-GTTCTAGCTCTGCTTC-3,8PR-RT基因擴(kuò)5,-CTGCCAATTCTAATTCTGCTTC-3,5,-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3,5,-TGGAAATGTGGAAAAGAAGGAC-3,PCR5,-CTGTATTTCAGCTATCAAGTCTTTTGATGGG-3,5,-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3,5,-GGACCTACACCTGTCAAC-3,5,-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3,5,-GCTGGGTGTGGTATTCC-3,5,-CTGCCAATTCTAATTCTGCTTC-3,5,-GGRATYATTCARGCACAACCAG-3,5,-GCATTAGGRATYATTCARGCAC-3,5,-TGGGATRTGTACTTCYGARCTTA-3,5,-TCTAYCTGKCATGGGTRCCAGCAC-3,–5214-5192PCR5,-CATCCTGTCTACYTGCCACAC-3,–5088-50685,-TCTAYCTGKCATGGGTRCCAGCAC-3,5,-CATCCTGTCTACYTGCCACAC-3,5,-GGVATTCCCTACAATCCCCAAAG-3,5,-GAATACTGCCATTTGTACTGCTG-3,–5088-506895,-TTGGAGGAAATGAACAAGTAGATAAATTAGT-3,5,-AATCCTCATCCTGTCTACTTGCCACACAATC-3,5,-TTTTAGATGGAATAGATAAGGCYCAAGA-3,PCR5,-GCCACACAATCATCACCTGCCATCTGTTTT-3,5,-TTTTAGATGGAATAGATAAGGCYCAAGA-3,5,-GCCACACAATCATCACCTGCCATCTGTTTT-3,5,-TAAGACAGCAGTACAAATGGCAG-3,5,-GCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3,4919-4899包括序列清理、拼接和混合堿基判斷，以及序列處理過程中的質(zhì)量對測序片段兩端較為集中的模糊堿基和堿基信號可信度較低的區(qū)域進(jìn)行剪將高質(zhì)量序列與HIV-1標(biāo)準(zhǔn)參考株(HXB2)或其他參基于變異檢測中的突變結(jié)果，將每個位點最高頻率的堿基按照HIV-1參考基因組上的位置排列，獲將比對到HIV-1測序區(qū)域的序列提取出來，根據(jù)序列之間重疊區(qū)域?qū)π蛄衅芜M(jìn)行拼接、延伸，最D.1斯坦福大學(xué)HIV耐藥分析數(shù)據(jù)庫（HD.2法國國家艾滋病研究署（ANRS）HIV耐藥D.3中國艾滋病病毒基因序列數(shù)據(jù)平臺耐藥分析數(shù)據(jù)庫（提供在線耐藥分析工具，提交HIV基因序列，判斷首選HIV感染者的全血制備干血斑陽性對照，也可用HIV陰性人全血稀釋HIV對上述技術(shù)指標(biāo)應(yīng)至少檢測3次，準(zhǔn)確鑒定HIV-1基常規(guī)方法采集全血、血漿或收獲病毒培養(yǎng)上清液，用HIV陰性的人全血或血漿稀釋成特定的病毒載滿足較長時間（一年）使用的量；血漿樣本分裝，干血斑樣本置于含干燥劑的密封袋中，-70℃保進(jìn)行RT-PCR時，應(yīng)增加由去離子水代替模根據(jù)待檢人群的抗病毒治療史及使用的藥物，選擇含有在待檢人群中預(yù)計流行率最高的耐藥突變驗室分區(qū)不嚴(yán)格、或人員操作經(jīng)驗不足等，可增加使用陰性對照的數(shù)量，如每50份待檢樣本使用2~3份[3]StanfordUniversityHIVDrugResistanedition.Geneva:WorldHealthOrganiz