專題九4.基因工程1～6題每題7分，7～9題每題8分，共66分。1．(2024·江西，12)γ-氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。利用L-谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L-谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L-谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導(dǎo)入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是()A．圖示表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB．E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ-氨基丁酸時，L-谷氨酸鈉的作用是供能C．E.coliA和E.coliB都能高效降解γ-氨基丁酸D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒2．(2024·浙江強(qiáng)基聯(lián)盟高三聯(lián)考)東南景天中的HMA3基因能編碼Cd(鎘)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能將土壤中的Cd吸收進(jìn)體內(nèi)。現(xiàn)欲將東南景天中的HMA3基因轉(zhuǎn)入欒樹，以增強(qiáng)欒樹對Cd的富集能力，從而有效治理Cd污染，科研人員利用圖示結(jié)構(gòu)構(gòu)建重組DNA，圖1為HMA3基因所在DNA示意圖，圖2為質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。下列敘述正確的是()A．欲獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進(jìn)行PCR循環(huán)至少2輪獲得B．用凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，引物1、引物2擴(kuò)增的產(chǎn)物可得3條條帶C．構(gòu)建含HMA3和GFP基因的重組質(zhì)粒，需在引物上添加BglⅡ和HindⅢ的識別序列D．用含潮霉素的培養(yǎng)基篩選受體細(xì)胞，能生長的為含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞3．由于PCR擴(kuò)增出的目的基因末端為平末端，且無合適的限制酶識別序列，需借助中間載體P將目的基因接入載體E。圖示為兩種載體的結(jié)構(gòu)和相關(guān)限制酶的識別序列，下列敘述正確的是()A．構(gòu)建重組載體P時，應(yīng)選擇EcoRⅤ進(jìn)行酶切，再用T4DNA連接酶連接B．為了便于該目的基因接入載體E，可用限制酶EcoRⅤ或SmaⅠ切割載體PC．載體P不能作為基因表達(dá)載體，是因?yàn)樗缓鹗济艽a子和終止密碼子D．若受體細(xì)胞表現(xiàn)出抗性基因的相應(yīng)性狀，表明重組載體成功導(dǎo)入受體細(xì)胞4．目的基因和載體如果用同一種限制酶處理，連接時會出現(xiàn)正反接的情況，為鑒定篩選出的表達(dá)載體中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進(jìn)行PCR后，結(jié)合電泳技術(shù)鑒定，圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，其中目的基因?yàn)殚L度300bp的片段。下列有關(guān)說法錯誤的是()A．PCR復(fù)性溫度不宜太低，避免引物錯配和模板鏈形成雙鏈B．電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)C．選取引物甲、丙，擴(kuò)增出450bp長度片段時，可以說明目的基因正接D．選取引物甲、乙，擴(kuò)增出400bp長度片段時，可以說明目的基因反接5．普通棉花中β-甘露糖苷酶基因表達(dá)出的GhMnaA2能催化半纖維素降解，使棉纖維長度變短。為了培育長絨棉，科研人員構(gòu)建了反義GhMnaA2基因表達(dá)載體(將正義GhMnaA2基因與載體反向連接)，獲得了轉(zhuǎn)基因長絨棉新品種，具體過程如圖所示，圖中SmaⅠ、NotⅠ、HindⅢ和BamHⅠ代表相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。用SmaⅠ和NotⅠ切割某正義表達(dá)載體可獲得3kb、18kb、28kb、59kb4種長度的DNA片段。下列敘述正確的是()A．正義GhMnaA2基因的轉(zhuǎn)錄方向是B→AB．過程①得到的表達(dá)載體均為反義表達(dá)載體C．反義GhMnaA2基因可能通過抑制GhMnaA2基因的翻譯來保證棉纖維長度D．用NotⅠ切割反義表達(dá)載體獲得的DNA片段的長度為21kb和87kb6．雙向啟動子可同時結(jié)合兩個RNA聚合酶來驅(qū)動下游基因的表達(dá)，研究人員構(gòu)建了圖示表達(dá)載體，以檢測雙向啟動子作用效果。下列分析不正確的是()A．可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞B．為連入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質(zhì)粒C．在培養(yǎng)基中添加壯觀霉素可篩選出成功導(dǎo)入該表達(dá)載體的微生物受體細(xì)胞D．可通過觀察是否出現(xiàn)熒光和藍(lán)色物質(zhì)確認(rèn)雙向啟動子的作用7．研究人員將目的基因插入質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程如圖所示，再將該重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中。由β-半乳糖苷酶基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色，否則菌落為白色。下列敘述錯誤的是()A．將目的基因插入質(zhì)粒中時，需要用到的酶有XhoⅠ、NheⅠ和DNA連接酶B．需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)C．按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，大腸桿菌可正常表達(dá)該目的基因D．在含X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，可出現(xiàn)藍(lán)色菌落8．人類Y基因啟動子上游的調(diào)控序列中含有BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)結(jié)合BCL11A蛋白后，r基因的表達(dá)被抑制。通過改變該結(jié)合位點(diǎn)的序列，解除對基因表達(dá)的抑制，可對某種地中海貧血癥進(jìn)行基因治療?？蒲腥藛T擴(kuò)增了r基因上游不同長度的片段(Fn與R)，將這些片段分別插入表達(dá)載體中進(jìn)行轉(zhuǎn)化和熒光檢測，以確定BCL11A蛋白結(jié)合位點(diǎn)的具體位置，相關(guān)信息如圖所示。下列有關(guān)敘述錯誤的是()A．為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入載體，指導(dǎo)熒光蛋白基因表達(dá)，需用MunⅠ和XhoⅠ處理載體B．從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個過程需構(gòu)建7種載體C．將構(gòu)建的載體導(dǎo)入去除BCL11A基因的受體細(xì)胞，可能出現(xiàn)含F(xiàn)1與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光，而含F(xiàn)2～F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞有熒光D．向培養(yǎng)液中添加適量的雌激素，可導(dǎo)致部分受體細(xì)胞不再有熒光9．Cre/LoxP系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)特定基因的敲除(如圖1)。把幾種熒光蛋白基因和Cre酶能識別并切割的序列(LoxP1和LoxP2)串在一起，構(gòu)建表達(dá)載體T(如圖2)。部分熒光蛋白基因會被Cre酶隨機(jī)“剪掉”，且兩個LoxP1之間或兩個LoxP2之間的基因，最多會被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表達(dá)，隨機(jī)呈現(xiàn)不同的顏色。下列說法錯誤的是()A．Cre酶切下一個待敲除基因的過程，需要破壞四個磷酸二酯鍵B．若小鼠細(xì)胞含一個表達(dá)載體T(不含Cre酶)，其肌肉組織細(xì)胞呈紅色C．若小鼠細(xì)胞含一個表達(dá)載體T(含Cre酶)，其腦組織細(xì)胞呈紅色或黃色或藍(lán)色D．若小鼠細(xì)胞含兩個表達(dá)載體T(含Cre酶)，其一個腦組織細(xì)胞內(nèi)可能隨機(jī)出現(xiàn)兩種顏色10．(14分)(2024·山東，25節(jié)選)研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過脫落酸信號途徑調(diào)控大豆的逆境響應(yīng)。利用基因工程技術(shù)編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaⅠ切點(diǎn)處插入大豆基因L的向?qū)NA序列，將載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導(dǎo)核酸酶特異性結(jié)合基因組上的目標(biāo)序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標(biāo)基因L部分序列及相關(guān)結(jié)果等如圖所示。LB/RB：T－DNA的邊界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；AmpR：氨芐青霉素抗性基因。甲載體信息乙目標(biāo)基因L部分序列丙限制酶識別序列、切割位點(diǎn)及電泳結(jié)果(1)用PCR技術(shù)從大豆基因組DNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因L時，所用的引物越短，引物特異性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有______種。載體信息如圖甲所示，經(jīng)BsaⅠ酶切后，載體上保留的黏性末端序列應(yīng)為5′－__________－3′和5′－________－3′。(2)重組載體通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入大豆細(xì)胞，使用抗生素________篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點(diǎn)如圖乙所示，PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是____________，其中純合的突變植株是________(填序號)。11．(8分)(2024·寧波高三三模)為研究高分子量HA能否提高小鼠的壽命，研究人員進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)(如圖)?；卮鹣铝袉栴}：NeoR：新霉素抗性基因；nmrHas2：裸鼠HA合成酶2基因；CE：cre重組酶－雌激素受體融合基因注：啟動子僅啟動相鄰基因的表達(dá)。(1)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠A：為了將目的基因插入小鼠6號染色體的特定位點(diǎn)，需在其兩端設(shè)計與6號染色體同源序列，實(shí)現(xiàn)同源序列之間的重組。由此獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠A暫時無法表達(dá)HA合成酶2，原因是____________________________________________。(2)B鼠為導(dǎo)入表達(dá)CE的純合子，CE也插入6號染色體的相同位點(diǎn)。外源雌激素可誘導(dǎo)cre重組酶活化，活化的cre重組酶能識別并切除loxP位點(diǎn)間的序列。A、B鼠交配獲得C、D鼠，請畫出C鼠的基因組成情況。(3)利用C、D鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測得實(shí)驗(yàn)組小鼠HA含量升高，癌癥概率降低、炎癥反應(yīng)減少，壽命也得到了延長。請寫出對照組的選材____________(填“C”或“D”)及實(shí)驗(yàn)處理是________________________________________________________________________。12．(12分)(2024·紹興高三聯(lián)考)人促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種可用于治療腎性貧血的糖蛋白類激素，可用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)EPO?？蒲腥藛T利用大鼠乳清酸蛋白(WAP)基因上游的調(diào)控序列及啟動子和3′UTR序列構(gòu)建了基因表達(dá)載體。構(gòu)建前，科研人員擴(kuò)增了WAP基因上游不同長度的片段，將這些片段分別插入EPO基因中，以確定WAP基因啟動子的具體位置。相關(guān)信息如圖所示，回答下列問題：(1)為將擴(kuò)增后的產(chǎn)物定向插入基因表達(dá)載體中，以指導(dǎo)EPO基因的表達(dá)，需要在引物末端添加特定的限制酶識別序列。由圖中信息可知，在P1～P4末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是________，在A末端添加的序列所對應(yīng)的限制酶是________。(2)將通過PCR處理后的含不同長度的WAP基因上游序列與EPO基因連接，構(gòu)建成表達(dá)載體的過程中，需要________種限制酶切割上述DNA片段。檢測轉(zhuǎn)基因雌性大鼠時發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入含P1～P3與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個體乳汁中有EPO，而含P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個體沒有EPO生成。含P4與A擴(kuò)增產(chǎn)物的個體沒有EPO生成的原因是____________________________________。(3)該實(shí)驗(yàn)中，在EPO基因上游插入大鼠WAP基因啟動子的理由是______________________。(4)科研人員不選用大腸桿菌作為該實(shí)驗(yàn)的受體細(xì)胞，從基因表達(dá)的角度分析，其原因是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案精析1．A[由圖示可知，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確；由題干可知，E.coliB以L-谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ-氨基丁酸，因此L-谷氨酸鈉為反應(yīng)底物，而不是起供能作用，B錯誤；E.coliA和E.coliB均為生產(chǎn)γ-氨基丁酸的菌種，故二者均不能高效降解γ-氨基丁酸，C錯誤；根據(jù)題干及題圖給出的信息，無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒，D錯誤。]2．C[欲獲取HMA3基因，可用引物1、引物2進(jìn)行PCR循環(huán)至少3輪獲得，A錯誤；用凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，引物1、引物2擴(kuò)增的產(chǎn)物可能會得到多條不同的條帶，B錯誤；用含潮霉素的培養(yǎng)基篩選受體細(xì)胞，能生長的為含重組質(zhì)粒或不含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，這兩種都有可能，D錯誤。]3．A4．C[復(fù)性是在高溫解旋后降低溫度讓引物與模板鏈結(jié)合，復(fù)性溫度不宜太低，避免引物錯配和模板鏈形成雙鏈，A正確；電泳條帶遷移的位置和速度與DNA分子的大小和構(gòu)象有關(guān)，電泳一段時間后，較大的DNA分子遷移距離小，離加樣孔近，而較小的DNA分子遷移距離大，離加樣孔遠(yuǎn)，B正確；由于使用的引物是甲和丙，沒有與基因相應(yīng)位置配對，因此不管目的基因正接還是反接，擴(kuò)增出的片段均為450bp，C錯誤；選取引物甲和乙，擴(kuò)增出400bp長度片段時，可以說明目的基因反接，若正接，不能擴(kuò)增出100bp的片段，D正確。]5．C[由圖可知，反義表達(dá)載體中，反義GhMnaA2基因轉(zhuǎn)錄方向是B→A，則正義GhMnaA2基因的轉(zhuǎn)錄方向是A→B，A錯誤；由于只能由SmaⅠ來構(gòu)建反義表達(dá)載體，因此過程①得到的表達(dá)載體可能為反義表達(dá)載體，也可能為正義表達(dá)載體，B錯誤；反義GhMnaA2基因轉(zhuǎn)錄出來的RNA與正常轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)，從而阻止其與核糖體結(jié)合，即反義GhMnaA2基因可能通過抑制GhMnaA2基因的翻譯來保證棉纖維長度，C正確；用SmaⅠ和NotⅠ切割正義表達(dá)載體可獲得3kb、18kb、28kb、59kb4種長度的DNA片段，據(jù)此判斷左側(cè)SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是59kb，A位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是3kb，B位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是18kb，右上角E6位置處SmaⅠ和NotⅠ之間的長度是28kb，故用NotⅠ切割反義表達(dá)載體獲得的DNA片段的長度應(yīng)分別為18＋28＝46(kb)和3＋59＝62(kb)，D錯誤。]6．B[將基因表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞常用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，A正確；如果用SphⅠ酶切已整合了雙向啟動子及LUC基因的質(zhì)粒時就會破壞LUC基因，B錯誤；如果成功導(dǎo)入含有壯觀霉素抗性基因的基因表達(dá)載體，受體細(xì)胞就具有抗壯觀霉素的能力，在含有壯觀霉素的培養(yǎng)基上能生存，因此可以篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的微生物受體細(xì)胞，C正確；雙向啟動子如果正常表達(dá)，就會合成熒光素酶和β-葡萄糖苷酶，二者催化底物分別產(chǎn)生熒光或生成藍(lán)色物質(zhì)，從而確定雙向啟動子的作用，D正確。]7．C[目的基因兩側(cè)含有限制酶XhoⅠ、NheⅠ的識別序列，將目的基因插入質(zhì)粒中時，需要用到限制酶XhoⅠ、NheⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接在一起，A正確；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時，需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，B正確；按圖示構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后，由于目的基因的轉(zhuǎn)錄方向和啟動子的方向相反，大腸桿菌不能正常表達(dá)該目的基因，C錯誤；在含X-gal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，β-半乳糖苷酶基因編碼產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，使菌落呈藍(lán)色，D正確。]8．C[從產(chǎn)物擴(kuò)增到載體構(gòu)建完成的整個過程需構(gòu)建7種載體，即F1～F7與R的相關(guān)載體，B正確；據(jù)圖可知，F(xiàn)1與R的序列要長于F2～F7與R序列，故不可能出現(xiàn)含F(xiàn)1與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞無熒光，而含F(xiàn)2～F7與R擴(kuò)增產(chǎn)物的受體細(xì)胞有熒光的現(xiàn)象，C錯誤。]9．B[DNA單鏈上相鄰的兩個脫氧核苷酸之間通過磷酸二酯鍵相連，DNA由兩條單鏈螺旋纏繞形成，Cre酶切下一個待敲除基因的過程中，需要切斷基因前后兩端，因此需要破壞四個磷酸二酯鍵，A正確；據(jù)圖可知，小鼠有編碼紅、黃、藍(lán)熒光蛋白的基因，前端有腦組織特異性表達(dá)的啟動子，肌肉細(xì)胞不會表達(dá)顏色基因，故若小鼠細(xì)胞含一個表達(dá)載體T(不含Cre酶)，其肌肉組織細(xì)胞呈無色，B錯誤；小鼠腦組織細(xì)胞內(nèi)有2個相同表達(dá)載體T(含Cre酶)，Cre酶對每個DNA片段隨機(jī)剪切，因而細(xì)胞的顏色由細(xì)胞內(nèi)兩種熒光蛋白的顏色疊加而成，故其腦組織細(xì)胞可能隨機(jī)出現(xiàn)兩種顏色，D正確。]10．(1)低256(或44)GTTTCAAT(或CAATGTTT)(2)卡那霉素SacⅠ④解析(1)單鏈突出序列NNNN為黏性末端，N代表任意堿基，所以，用BsaⅠ酶切大豆基因組DNA，理論上能得到256種黏性末端。載體上有2個BsaⅠ酶切位點(diǎn)，最后兩個空序列為GTTT和CAAT，方向均從5′端到3′端。(2)導(dǎo)入大豆細(xì)胞中的T－DNA片段中含有卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據(jù)圖甲可知，目標(biāo)基因L的目標(biāo)序列跟突變序列之間只在SacⅠ酶切位點(diǎn)上存在差異，BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個酶切位點(diǎn)完全相同，根據(jù)圖丙及題意可知，要以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因L，并對PCR產(chǎn)物完全酶切后進(jìn)行電泳從而判斷植株含有的是目標(biāo)序列還是突變序列，因此只能選用限制酶SacⅠ，突變序列存在限制酶SacⅠ酶切位點(diǎn)，但是目標(biāo)序列沒有，因此經(jīng)過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會出現(xiàn)兩條，目標(biāo)序列是一條，根據(jù)圖丙結(jié)果可知，只有④為純合的突變植株。11．(1)啟動子未直接與HA合成酶2的基因相連(2)如圖所示(3)D注射外源雌激素解析(1)通過將目的基因插入小鼠6號染色體的特定位點(diǎn)，需在其兩端設(shè)計與6號染色體同源序列，實(shí)現(xiàn)同源序列之間的重組，由此獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠A，由于啟動子未直接與HA合成酶2的基因相連，因此轉(zhuǎn)基因小鼠A暫時無法表達(dá)HA合成酶2。(2)根據(jù)圖示可知小鼠A、B的基因組成，將A、B鼠交配獲得C、D鼠，C鼠基因組成圖示見答案。(3