1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備1.1.1實(shí)驗(yàn)材料牛肉：經(jīng)檢驗(yàn)β-受體激動(dòng)劑呈現(xiàn)陰性的牛肉，絞碎均質(zhì)。1.1.2主要試劑甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、高氯酸、氨水、氫氧化鈉溶液、乙酸銨緩沖液、甲酸水溶液-甲醇溶液（體積比=90∶10）、β-葡萄糖醛酸酶（30U·mL-1）。對(duì)照品：萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇（含量均≥98%）。同位素內(nèi)標(biāo)：萊克多巴胺-d3、克倫特羅-d9、沙丁胺醇-d3。1.1.3主要儀器設(shè)備TSQQuantis型號(hào)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）；分析天平；氮吹儀；水平振蕩器；固相萃取裝置等[1]。1.2混合對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)液的制備準(zhǔn)確稱取萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇各10mg,放置于100mL的棕色量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容，將其制備為0.1mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，4℃避光保存?zhèn)溆茫R用時(shí)可用甲醇稀釋為所需濃度混合液。稱取3種同位素內(nèi)標(biāo)10mg，同樣的方法配置為100μg·mL-1的儲(chǔ)備液保存，用時(shí)可用甲酸水溶液稀釋為100μg·L-1的混合液，獲得內(nèi)標(biāo)工作液[2]。1.3樣品前處理1.3.1酶解和提取稱取新鮮或者冷藏解凍的試料2g置于50mL離心管內(nèi)，加入0.2mol·L-1的乙酸銨緩沖液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μl，渦旋均勻，于避光條件下37℃水浴振蕩16h，放至室溫備用。1.3.2萃取、凈化、濃縮取上步驟獲得備用液，加入100ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)液100μL,渦旋均勻并在8000r·min-1的條件下離心8min，取上清液，加入5mL高氯酸溶液（0.1mol·L-1）,渦旋均勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH至1，在8000r·min-1的條件下離心8min，在獲得的上清液中加入NaOH溶液（10mol·L-1）,調(diào)節(jié)pH至10。加入乙酸乙酯15mL，中速振蕩5min，在5000r·min-1的條件下離心5min，獲取上層有機(jī)相。對(duì)于上層水相，可加入叔丁基甲醚10mL進(jìn)行提取，將前后2次提取的有機(jī)相進(jìn)行合并，50℃氮吹，并用甲酸溶液（2%）溶解備用[3]。應(yīng)用混合型陽離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化，分別用3mL甲醇及3%甲酸活化萃取柱后，備用液過柱后用2%甲酸與甲醇各3mL淋洗、抽干，用5%的氨化甲醇溶液3mL洗脫后50℃氮吹。用0.5mL甲醇-1%甲酸溶液溶解殘余物后過濾膜（0.22μm孔徑），獲得供試品溶液。1.4儀器條件色譜柱：WatersC18(XbridgeBEH2.5μm)；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：20μL；流速：0.2mL·min-1；流動(dòng)相：溶劑A+溶劑B。梯度洗脫程序見表1。表1流動(dòng)相及梯度洗脫程序表離子源：電噴霧（ESI+）；掃描方式：選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描（SRM）；離子噴霧電壓：3500V；離子傳輸管溫度：320℃；蒸汽溫度：350℃；鞘氣流速：40Arb；輔助氣流速：5Arb。2結(jié)果與分析2.1酶解溫度的優(yōu)化通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，β-葡萄糖醛酸酶適用的溫度處于40～110℃，于試料牛肉離心管內(nèi)，加入0.2mol·L-1的乙酸銨緩沖液6mL、β-葡萄糖醛酸酶40μL,渦旋均勻后分別于避光條件下37、45、53、61、69℃水浴振蕩16h，再經(jīng)萃取、凈化、濃縮后對(duì)3種β-受體激動(dòng)劑含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表2。表2不同酶解溫度對(duì)β-受體激動(dòng)劑測(cè)定結(jié)果的影響表表2顯示,當(dāng)酶解溫度在37～45℃范圍內(nèi)時(shí)，3種β-受體激動(dòng)劑的測(cè)定結(jié)果差距不明顯,均與推薦值最接近，隨著溫度的繼續(xù)升高，在達(dá)到53℃后，測(cè)定值會(huì)有所降低，這可能因?yàn)闇囟冗^高會(huì)導(dǎo)致物質(zhì)揮發(fā)丟失。所以，最合適的酶解溫度為37℃[4-5]。2.2酶解時(shí)間的優(yōu)化設(shè)置樣品酶解與提取前處理的酶解時(shí)間為37℃下水浴振蕩8、12、16、20、24h，再經(jīng)萃取、凈化、濃縮后對(duì)3種β-受體激動(dòng)劑含量檢測(cè)，結(jié)果見表3。表3不同酶解時(shí)間對(duì)β-受體激動(dòng)劑測(cè)定結(jié)果的影響表表3顯示，酶解時(shí)間為8、12、16h時(shí)，β-受體激動(dòng)劑含量測(cè)定值差距相對(duì)較小，均接近推薦值5μg·kg-1，適合酶解時(shí)間為8h。2.3凈化條件的優(yōu)化應(yīng)用SPE技術(shù)凈化，分別創(chuàng)建4種淋洗液與洗脫程序，研究加標(biāo)回收率，選擇最佳凈化條件，具體見表4。表4不同凈化條件的β-激動(dòng)劑回收率表表4顯示，方法1與方法2下3種β-激動(dòng)劑的平均回收率差異性不大，分別為98.5%、98.4%。因此，該實(shí)驗(yàn)凈化條件可以選擇方法1或者方法2。2.4方法回收率分析各稱取牛肉樣品2g，按照上述最佳前處理?xiàng)l件，分別添加不同梯度的3種β-受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0、5、5、10ng，并定容至1mL，計(jì)算其分析結(jié)果及回收率見表5。表53種β-受體激動(dòng)劑加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表由表5可知，β-受體激動(dòng)劑化合物的加標(biāo)回收率處于84.6%～97.2%，代表該檢測(cè)方法具備較高的準(zhǔn)確度，可以滿足檢測(cè)要求。3結(jié)語本實(shí)驗(yàn)采用酶解與固相萃取的前處理技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用對(duì)牛肉中的3種β-受體激動(dòng)劑進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)最佳的酶解溫度為37℃，酶解時(shí)間為8h，凈化條件如下?；罨?mL甲醇；3