1氨肽酶等8種食品添加劑新品種相關(guān)材料一、擬征求意見的食品添加劑新品種名單（一）食品工業(yè)用酶制劑新品種序號供體1氨肽酶Aminopeptidase李氏木霉Trichodermareesei棒曲霉Aspergillusclavatus2木聚糖酶Xylanase李氏木霉Trichodermareesei輪枝鐮刀菌Fusariumverticillioides食品工業(yè)用酶制劑的質(zhì)量規(guī)格要求應(yīng)符合《食品安全國家（二）食品營養(yǎng)強化劑新品種1.中文名稱：3-巖藻糖基乳糖英文名稱：3-fucosyllactose，3-FL功能分類：食品營養(yǎng)強化劑用量及使用范圍食品分類號食品名稱使用量備注01.03.02調(diào)制乳粉(僅限兒童用乳粉)0.25-1.75狀態(tài)計，粉當與2’-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖、低嬰兒配方食品2食品分類號食品名稱使用量備注較大嬰兒和幼兒配方食品狀產(chǎn)品按沖調(diào)倍數(shù)折算使用量)果糖、多聚果質(zhì)總量不超過64.5g/kg。特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品質(zhì)量規(guī)格要求干燥等工藝制得的營養(yǎng)強化劑3-巖藻糖基乳糖。3-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌應(yīng)經(jīng)過安全性評估并符合附錄C的要求。2化學名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對分子質(zhì)量2.1化學名稱2.2分子式C18H32O152.3結(jié)構(gòu)式32.4相對分子質(zhì)量488.44（按2022年國際相對原子質(zhì)量）3.技術(shù)要求3.1感官要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。項目檢驗方法色澤白色至類白色取適量試樣置于清潔、干燥的白瓷盤或燒杯中，在自然光線下，觀察其色澤和狀態(tài)。狀態(tài)粉末3.2理化指標理化指標應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標項目指標檢驗方法計w/%≥90.0D-乳糖，w/%≤L-巖藻糖，w/%≤D-半乳糖和D-葡萄糖，w/%≤2.0a，w/%<0.5水分，w/%≤休法灰分，w/%≤0.5GB5009.4殘留蛋白/（mg/kg）≤4內(nèi)毒素/（EU/mg）≤0.2GB5009.11鉛（Pb）/（mg/kg）≤0.05GB5009.12a僅適用于以乙醇作為溶劑制得的3-巖藻糖基乳糖產(chǎn)品。3.3微生物指標微生物指標應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3微生物指標項目指標檢驗方法菌落總數(shù)/（CFU/g）≤GB4789.2腸桿菌科/（CFU/g）<GB4789.41沙門氏菌/（25g）不得檢出GB4789.45附錄A檢驗方法A.1一般規(guī)定本質(zhì)量規(guī)格要求所用的試劑和水，在未注明其他要求時，均指分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。試驗中所用標準溶液、雜質(zhì)測定用標準溶液、制劑和制品，在未注明其他要求時，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。試驗中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時，均指水溶液。A.23-巖藻糖基乳糖（以干基計）的測定A.2.1高效液相色譜-示差折光檢測器測定（方法一）A.2.1.1方法提要3-巖藻糖基乳糖溶于水或溶劑，在氨基鍵合色譜柱的液相色譜條件下分離，示差折光檢測器檢測，用外標法定量。A.2.1.2試劑和材料A.2.1.2.13-巖藻糖基乳糖對照品（CAS41312-47-4純度≥90%。A.2.1.2.2D-乳糖對照品（CAS63-42-3純度≥98%。A.2.1.2.3水：GB/T6682規(guī)定的一級水。A.2.1.2.4乙腈：色譜純。A.2.1.3儀器和設(shè)備A.2.1.3.1高效液相色譜儀：配備示差折光檢測器。A.2.1.3.2電子天平：感量為0.00001g。6A.2.1.3.3超聲波清洗機。A.2.1.3.4循環(huán)水式多用真空泵。A.2.1.4參考色譜條件或等效色譜柱。A.2.1.4.2流動相：乙腈:水=72:28（v/v可根據(jù)實際儀器系A(chǔ).2.1.4.3柱溫：25℃。A.2.1.4.4示差折光檢測器溫度：37℃。A.2.1.4.5流速：1mL/min。A.2.1.4.6進樣量：20μL。A.2.1.4.7運行時間：15min。A.2.1.5分析步驟A.2.1.5.1系列標準溶液的配制分別準確稱取三份適量的3-巖藻糖基乳糖對照品，轉(zhuǎn)移到合適的容量瓶中，加水溶解并用流動相稀釋，得到系列標準溶液1、2和3。根據(jù)對照品溶液純度折算后3-巖藻糖基乳糖的濃度分別為4.0mg/mL、5.0mg/mL和6.0mg/mL。A.2.1.5.2系統(tǒng)適用性試驗溶液的配制稱取D-乳糖對照品10mg，置10mL容量瓶中，用水稀置10mL容量瓶中，加D-乳糖對照品儲備液1mL，加流動7相溶解并稀釋至刻度，含3-巖藻糖基乳糖和D-乳糖分別為5mg/mL和0.1mg/mL混合溶液作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。A.2.1.5.3試樣溶液配制準確稱取試樣50.0mg~54.0mg于10mL容量瓶中，用溶劑溶解并定容至刻度，搖勻。相同試樣做三個平行實驗。A.2.1.5.4系統(tǒng)適用性試驗當滿足以下條件時，可進行試樣溶液的測定：——空白溶劑除溶劑峰外無其他色譜峰干擾?！到y(tǒng)適用性溶液中3-巖藻糖基乳糖與D-乳糖的分離度應(yīng)不小于1.5。——連續(xù)進樣3次系列標準溶液，進樣標準溶液2時，3-巖藻糖基乳糖峰信噪比應(yīng)大于50。系統(tǒng)適用性試驗參考色譜圖譜見附錄B.1。A.2.1.5.5進樣順序空白溶劑，系列標準溶液1、2和3，試樣溶液，系列標準溶液1、2和3。前后測得系列標準溶液中相同濃度的對照品峰面積的相對偏差需小于2.0%。如不滿足偏差限度要求，需要復測。A.2.1.5.63-巖藻糖基乳糖（以干基計）的測定以系列標準溶液中3-巖藻糖基乳糖的濃度為橫坐標，相應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制過零點的線性標準曲線，依試樣溶液的峰面積在標準曲線上確定其中3-巖藻糖基乳糖的濃度。83-巖藻糖基乳糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω1按式（A.1）計算。..................C1——由標準曲線得到的試樣溶液中3-巖藻糖基乳糖的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mLV1——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）;m1——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）。3-巖藻糖基乳糖（以干基計）含量的質(zhì)量分數(shù)ω2按式（A.2）計算：....................（A.2）ω1——3-巖藻糖基乳糖含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω——產(chǎn)品水分含量實測值，%。A.2.2高效離子交換色譜-脈沖安培檢測器測定（方法二）A.2.2.1方法提要3-巖藻糖基乳糖溶于水，采用高效離子交換色譜-脈沖安培檢測器測定，用保留時間定性，外標法定量。A.2.2.2試劑和材料A.2.2.2.13-巖藻糖基乳糖對照品（CAS41312-47-4）：純度A.2.2.2.2氫氧化鈉溶液：50%（w/w）。A.2.2.2.3三水合乙酸鈉：純度≥99.0%。9A.2.2.3儀器和設(shè)備A.2.2.3.1高效離子交換色譜儀：配備脈沖安培檢測器。A.2.2.3.2天平：感量為0.0001g。A.2.2.4參考色譜條件A.2.2.4.1色譜柱：具有強聚合物陰離子交換樹脂的糖離子交換柱：250mm×4mm或等效色譜柱；保護柱：具有強聚合物陰離子交換樹脂的糖離子交換柱：50mm×4mm或等效色譜柱。A.2.2.4.2流動相流動相A（200mM氫氧化鈉溶液量取10.56mL50%的氫氧化鈉溶液，用水定容至1L。流動相B（200mM氫氧化鈉溶液+300mM乙酸鈉溶液稱量41g三水合乙酸鈉，加入適量水溶解，然后量取10.56mL50%的氫氧化鈉溶液，混合均勻，用水定容至1L。流動相C：水。A.2.2.4.3洗脫條件見下表。時間（min）流動相比例（體積，%）ABC49.7252520~3649.7A.2.2.4.4柱溫：20℃。A.2.2.4.5檢測器溫度：35℃。A.2.2.4.6流速：1.0mL/min。A.2.2.4.7進樣量：10μL。A.2.2.4.8運行時間：36min。A.2.2.4.9檢測電位：E1=3=+0.60Vt4=70ms。量程：50μA。注：En為電壓，tn為步長的持續(xù)時間，ts為步長1結(jié)束時樣品的測量間隔。A.2.2.5分析步驟A.2.2.5.1標準儲備溶液的配制準確稱取適量的3-巖藻糖基乳糖對照品，轉(zhuǎn)移到合適的容量瓶中，用水溶解，配制成濃度約為1000μg/mL的3-巖藻糖基乳糖標準儲備溶液。A.2.2.5.2標準工作溶液的配制按照表A.2移取不同體積的3-巖藻糖基乳糖標準儲備溶液，用水定容至10mL，制成系列標準工作溶液。表A.23-巖藻糖基乳糖標準工作溶液標準工作溶3-巖藻糖基乳糖標準儲備溶（mL）（mL）標準工作溶液的濃度(μg/mL）124.040044.54505*標準工作溶液3需進行額外處理。除了4.0mL3-巖藻糖基乳糖標準儲備溶液外，額外添加1.0mL20μg/mLD-乳糖儲備溶液和1.0mL20μg/mLL-巖藻糖儲備溶液后，定容。A.2.2.5.3試樣溶液的配制加水至約容量瓶刻度線2cm以下，振蕩溶解，然后用水定容，配制成濃度約為425μg/mL的試樣溶液。每份試樣做三個平行試驗。A.2.2.5.4測定以水為空白樣，進樣至少兩次以平衡色譜柱。按照低濃度到高濃度的順序測量標準工作溶液，然后測量試樣溶液。之后，再次測量標準工作溶液。參考色譜圖見附錄B.2。A.2.2.5.53-巖藻糖基乳糖（以干基計）含量計算3-巖藻糖基乳糖含量以外標法定量（以進樣前后分別進樣一組標準溶液來校準）。以系列標準溶液中3-巖藻糖基乳糖的濃度為橫坐標，以進樣前和進樣后測量的相應(yīng)標準溶液水平的平均峰面積為縱坐標繪制線性標準曲線，依試樣溶液的峰面積在標準曲線上確定其中3-巖藻糖基乳糖的濃度。3-巖藻糖基乳糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω3按式（A.3）計算。...................（A.3）...................C2——由標準曲線得到的試樣溶液中3-巖藻糖基乳糖的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mLV2——試樣的定容體積，單位為毫升（mL）;m2——試樣的質(zhì)量，單位為毫克（mg）。三次進樣測定結(jié)果的相對標準偏差不超過2%，結(jié)果取算術(shù)平均值。3-巖藻糖基乳糖（以干基計）含量的質(zhì)量分數(shù)ω4按式（A.4）計算：....................（A.4）ω3——3-巖藻糖基乳糖含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω——產(chǎn)品水分含量實測值，%。結(jié)果保留小數(shù)點后一位。A.3D-乳糖和L-巖藻糖的測定A.3.1高效液相色譜-示差折光檢測器測定（方法一）A.3.1.1方法提要3-巖藻糖基乳糖樣品溶于水或溶劑，在氨基鍵合色譜柱的液相色譜條件下分離，使用示差折光檢測器檢測，以D-乳糖，L-巖藻糖對照品的保留時間定性，面積歸一化法定量。A.3.1.2試劑和材料A.3.1.2.1D-乳糖對照品（CAS63-42-3純度≥98%。A.3.1.2.2L-巖藻糖對照品（CAS2438-80-4）：純度≥95%。A.3.1.2.3D-葡萄糖對照品（CAS50-99-7）：純度≥98%A.3.1.2.4D-半乳糖對照品（CAS59-23-4）：純度≥98%。A.3.1.2.5水：GB/T6682規(guī)定的一級水。A.3.1.2.6乙腈：色譜純。A.3.1.3儀器和設(shè)備A.3.1.3.1高效液相色譜儀：配備示差折光檢測器。A.3.1.3.2電子天平：感量為0.0001和0.00001g。A.3.1.3.3超聲波清洗機。A.3.1.3.4循環(huán)水式多用真空泵。A.3.1.4參考色譜條件或等效色譜柱。A.3.1.4.2流動相：乙腈:水=80:20（v/v可根據(jù)實際儀器系統(tǒng)調(diào)整比例）。A.3.1.4.3柱溫：25℃。A.3.1.4.4示差折光檢測器溫度：37℃。A.3.1.4.5流速：1mL/min。A.3.1.4.6進樣量：5μL。A.3.1.4.7運行時間：30min。A.3.1.5分析步驟A.3.1.5.1系統(tǒng)適用性試驗溶液的配制分別稱取D-乳糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖對照品和試樣各約10mg、10mg、5mg、5mg和500mg，置于同一10mL容量瓶中，加適量水溶解后用流動相定容并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。A.3.1.5.2系統(tǒng)適用性試驗連續(xù)進樣至少3次相同的標準溶液，進行系統(tǒng)適用性測試。當滿足以下條件時，可進行試樣溶液的測定：——D-乳糖、L-巖藻糖與相鄰其他成分的分離度應(yīng)不小——化合物保留時間和響應(yīng)值重復性的相對偏差均應(yīng)系統(tǒng)適用性試驗溶液的參考色譜圖譜見附錄B.3。A.3.1.5.3試樣溶液的配制精確稱取樣品適量（精確至1mg加入20mL容量瓶中，加適量水溶解后用流動相稀釋至刻度制成50mg/mL的溶液，搖勻，過濾，作為試樣溶液。A.3.1.5.4進樣順序空白溶劑1次，系統(tǒng)適用性試驗溶液連續(xù)進樣3次，試A.3.1.5.5D-乳糖和L-巖藻糖含量的測定試樣溶液中D-乳糖及L-巖藻糖含量以面積歸一法定量。D-乳糖及L-巖藻糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω5按式（.......................（A.5）A1——試樣溶液中D-乳糖或L-巖藻糖的峰面積；S1——試樣溶液中除溶劑峰之外的所有峰面積的總和。測定結(jié)果保留小數(shù)點后一位。該方法的檢出限約為A.3.2高效離子交換色譜-脈沖安培檢測器測定（方法二）A.3.2.1方法提要3-巖藻糖基乳糖溶于水，采用高效離子交換色譜-脈沖安培檢測器測定，以D-乳糖和L-巖藻糖對照品的保留時間定性，面積歸一化法定量。A.3.2.2試劑和材料A.3.2.2.1D-乳糖對照品（CAS63-42-3）：純度≥98.0%。A.3.2.2.2L-巖藻糖對照品（CAS2438-80-4純度≥95.0%。A.3.2.3儀器和設(shè)備A.3.2.4參考色譜條件A.3.2.5分析步驟A.3.2.5.1D-乳糖和L-巖藻糖標準儲備溶液的配制分別稱取一定量的D-乳糖對照品和L-巖藻糖對照品到適宜的容量瓶中，用水溶解，分別配制成濃度約為20μg/mL的標準儲備溶液。分別取標準儲備溶液1mL加入至3-巖藻糖基乳糖標準A.3.2.5.2試樣溶液配制A.3.2.5.3測定一次在進樣后以確定相應(yīng)的副產(chǎn)物。參考色譜圖見附錄B.2。A.3.2.5.4D-乳糖和L-巖藻糖含量測定D-乳糖和L-巖藻糖含量以面積歸一化法定量。D-乳糖及L-巖藻糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω6按式（.......................（A.6）A2——試樣溶液中D-乳糖或L-巖藻糖的峰面積；S2——試樣溶液中除溶劑峰之外的所有成分峰面積的總除非相對峰面積結(jié)果小于0.5%，否則三次進樣測定結(jié)果的相對標準偏差應(yīng)不超過3%。如果相對峰面積結(jié)果小于0.5%，結(jié)果表示為“相對峰面積＜0.5%”。結(jié)果取算術(shù)平均值，保留小數(shù)點后一位。A.4D-半乳糖和D-葡萄糖的測定3-巖藻糖基乳糖溶于水或溶劑，在氨基鍵合色譜柱的液相色譜條件下分離，使用示差折光檢測器檢測，以D-半乳糖和D-葡萄糖對照品的保留時間定性，面積歸一化法定量。A.4.1試劑和材料A.4.2儀器和設(shè)備A.4.3參考色譜條件A.4.4分析步驟A.4.4.1系統(tǒng)適用性試驗溶液的配制A.4.4.2系統(tǒng)適用性試驗系統(tǒng)適用性試驗的參考色譜圖譜見附錄B.3。A.4.4.3試樣溶液的配制A.4.4.4進樣順序A.4.4.5D-半乳糖和D-葡萄糖含量測定試樣溶液中D-半乳糖和D-葡萄糖含量以面積歸一法定D-半乳糖和D-葡萄糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω7按式（A.7）計.......................（A.7）A3——試樣溶液中D-半乳糖或D-葡萄糖的峰面積；S3——試樣溶液中除溶劑峰之外的所有峰面積的總和。A.5乙醇殘留的測定A.5.1方法提要試樣溶于適當?shù)娜軇?，頂空進樣氣相色譜氫火焰離子檢測器分析，外標法定量。A.5.2試劑和材料A.5.2.1無水乙醇：色譜級，含量≥99.8%。A.5.2.2水：GB/T6682規(guī)定的一級水。A.5.3儀器和設(shè)備A.5.3.1氣相色譜儀：配備氫火焰離子檢測器。A.5.3.2電子天平：精度為0.0001g。A.5.3.3頂空進樣器。A.5.4參考色譜條件A.5.4.1頂空條件A.5.4.1.1頂空瓶溫度：80℃。A.5.4.1.2定量環(huán)溫度：90℃。A.5.4.1.3傳輸線溫度：100℃。A.5.4.1.4頂空瓶平衡時間：30min。A.5.4.1.5氣相循環(huán)時間：22.8min。A.5.4.2色譜條件0.25μm或等效柱。A.5.4.2.2載氣：氮氣。A.5.4.2.3流量：1mL/min。A.5.4.2.4程序升溫條件：初始溫度60℃,維持5min，以A.5.4.2.5進樣口溫度：200℃。A.5.4.2.6檢測器溫度：250℃。A.5.4.2.7分流比：5:1。A.5.4.2.8進樣量：1mL。A.5.5分析步驟A.5.5.1對照品溶液的配制取無水乙醇1000mg于100mL容量瓶中，加水稀釋制容量瓶中，加水稀釋制成每1mL中含乙醇1m密量取5mL，置20mL容量瓶中，加水稀釋制成每1mL中含乙醇0.25mg的溶液，精密量取2mL置20mL頂空密封，作為對照品溶液。A.5.5.2試樣溶液室溫下輕輕振搖使樣品溶解，作為試樣溶液。A.5.5.3測定以水作為空白溶液，按照空白溶液1次，對照品溶液5次，試樣溶液順序分別頂空進樣測定，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算。A.5.5.4結(jié)果計算乙醇含量的質(zhì)量分數(shù)ω8按式（A.8）計算：.............（A.8）A4——試樣溶液中乙醇的峰面積；A5——對照品溶液乙醇峰面積的平均值；m3——乙醇對照品的稱樣量，單位為毫克（mgx——乙醇對照品的百分含量，%；f1——對照品的稀釋倍數(shù)；m4——試樣的稱樣量，單位為毫克（mg2——移取的溶液體積，單位為毫升（mL）。乙醇對照品的參考色譜圖譜見附錄B.5。A.6殘留蛋白含量的測定A.6.1方法提要考馬斯亮藍染色試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，在595nm波長下檢測吸光度用于蛋白質(zhì)測定。為了防止樣品基質(zhì)對顯色反應(yīng)的干擾，樣品溶液與不同濃度的牛血清白蛋白標準溶液混合后顯色，繪制二次標準曲線，計算樣品蛋白質(zhì)含量。A.6.2試劑和材料A.6.2.1牛血清白蛋白對照品：純度≥99%或標明含量的等同A.6.2.2考馬斯亮藍試劑：市售，適用于0.1mg/mL~1.4mg/mL蛋白含量的測定。A.6.3儀器和設(shè)備A.6.3.1紫外-可見分光光度計。A.6.3.2分析天平：感量0.0001g。A.6.4分析步驟A.6.4.1牛血清白蛋白儲備溶液的制備稱取20.0mg牛血清蛋白溶液對照品于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.6.4.2牛血清白蛋白標準溶液的制備取100μL上述儲備溶液于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.6.4.3試樣溶液的制備稱取200mg樣品于5mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.6.4.4測定按表A.3直接在比色皿中依次加入試樣溶液、水、牛血清白蛋白標準溶液和考馬斯亮藍試劑，混勻，室溫下靜置10min。然后以水為參比，在595nm波長下依次測定混合溶液的吸光度。表A.3測試試樣溶液的制備蛋白濃度（mg/L）試樣溶液(μL）牛血清標準溶液(μL）考馬斯亮(μL）空白溶液1000200空白溶液2000200混合溶液006002000200混合溶液11600200混合溶液22600200混合溶液346000200200A.6.4.5結(jié)果計算以混合溶液的吸光度分別減去空白溶液的吸光度得到校正吸光度。以校正吸光度為縱坐標，以牛血清蛋白標準溶液的濃度為橫坐標，繪制通過橫坐標左半軸交點的二次標準曲線。標準曲線與橫坐標左半軸交點對應(yīng)濃度值的絕對值即為試樣中蛋白的濃度。標準曲線的示意圖見圖A.1：圖A.1蛋白含量測定的標準曲線示意圖試樣中蛋白含量ω9按式（A.9）計算，單位為mg/kg。..............（A.9）C3——標準曲線與橫坐標左半軸交點對應(yīng)濃度值，數(shù)值為負值，單位為毫克每升（mg/L3——通過標準曲線求得的測定混合溶液中蛋白的濃度，單位為毫克每升（mg/LV3——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mLf2——稀釋因子；m5——試樣的質(zhì)量，單位毫克（mg0.6——1mL混合溶液中試樣溶液的體積為0.6mL；1000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。該方法的定量限為17mg/kg。若結(jié)果低于定量限，則結(jié)果表示為＜17mg/kg。結(jié)果保留整數(shù)位。在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過其算術(shù)平均值20%。A.7內(nèi)毒素的測定（凝膠法）A.7.1一般規(guī)定本測定所用的水應(yīng)符合細菌內(nèi)毒素檢查用水，試驗所用器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、至少30min）去除，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器具。試驗中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時，均指水溶液。A.7.2方法提要利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷試樣中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)，通過凝膠法進行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒A.7.3試劑和材料A.7.3.1細菌內(nèi)毒素標準品。A.7.3.2鱟試劑：帶有靈敏度標示值λ。A.7.3.3細菌內(nèi)毒素檢查用水：內(nèi)毒素含量＜0.015EU/mL。A.7.4儀器和設(shè)備A.7.4.1旋渦混合器。A.7.4.2恒溫水浴箱。A.7.5分析步驟A.7.5.1試樣溶液配制樣品加細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解。必要時，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般試樣溶液和鱟試劑混合堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應(yīng)不含內(nèi)毒素和干擾因子。A.7.5.2鱟試劑靈敏度復核試驗在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/mL表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復核試驗。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值(λ),將細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15min或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作。取不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，分別與等體積的鱟試劑溶液混合，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外取2管加入等體積的細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入將試管從恒溫水浴箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°,若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動，造成假陰性結(jié)果。當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc）按式（A.10）計算，單位為EU/mL。AC=antilgEX/n.....................（A.10）X——為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度；n——為每個濃度的平行管數(shù)。當λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。A.7.5.3干擾試驗按表A.4制備溶液A、B、C和D，使用的試樣溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指在試驗中試樣溶液被允許達到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測，MVD按式（A.11）計算：MVD=cl/A........................（A.11）c——為試樣溶液的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL如需計算在MVD時的試樣濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；L——為試樣的細胞內(nèi)毒素限值，單位為內(nèi)毒素單位每毫克（EU/mgλ——鱟試劑的標示靈敏度，單位為內(nèi)毒素蛋白每毫升表A.4凝膠法干擾試驗溶液的制備編號被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/試樣溶液———2B2λ/試樣溶液試樣溶液122λλ44480.5λ0.25λ44C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無/內(nèi)毒素檢查用水 2注：A為試樣溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗有效。當系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為試樣在該濃度下無干擾作用。其他情況則認為試樣在該濃度下存在干擾作用。若試樣溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將試樣溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再次重復干擾試驗。可通過對試樣進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的試樣溶液進行干擾試驗。當進行樣品的內(nèi)毒素檢查試驗前，須進行干擾試驗。當鱟試劑、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。A.7.5.4測定A.7.5.4.1凝膠限度試驗按表A.5制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD并且已經(jīng)排除干擾的試樣溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。表A.5凝膠限度試驗溶液的制備編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/試樣溶液2B2λ/試樣溶液2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水2D無/內(nèi)毒素檢查用水2注：A為試樣溶液；B為試樣陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。保溫60min±2min后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定試樣不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定，否則判定試樣不符合規(guī)定。若試樣的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定時，可將試樣稀釋至MVD重新實驗，再對結(jié)果進行判A.7.5.4.2凝膠半定量試驗通過確定反應(yīng)終點濃度來量化試樣中內(nèi)毒素的含量。按表A.6制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。表A.6凝膠半定量試驗溶液的制備編號被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無/試樣溶液檢查用水1248 2222B2λ/試樣溶液—12λ2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的試樣溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用內(nèi)毒素檢查用水稀釋如1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD；B為含2λ溶度內(nèi)毒素標準品的溶液A（試樣陽性對照）；C為鱟試劑標示靈敏度對照系列；D為陰性對照。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何A.7.5.5結(jié)果判定系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以λ,為每個系列的反應(yīng)終點濃度。如果檢驗的是經(jīng)稀釋的試樣，則將終點濃度乘以試樣進行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定試樣符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為試樣溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式cg=antilg(Eigc/2)]。若試驗中試樣溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的試樣，則記為小于λ乘以試樣進行半定量試驗若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時，則判定試樣不符合規(guī)定。當試樣溶液的所有平行管均為陽性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。附錄B3-巖藻糖基乳糖、D-乳糖、L-巖藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖、乙醇的參考色譜圖B.1高效液相色譜法測定3-巖藻糖基乳糖系統(tǒng)適用性參考色譜圖圖B.1高效液相色譜法測定3-巖藻糖基乳糖系統(tǒng)適用性試驗參考色譜圖表B.1高效液相色譜法測定3-巖藻糖基乳糖色譜條件下各物質(zhì)的保留時間化合物保留時間（min）D-乳糖3-巖藻糖基乳糖B.2高效離子色譜法測定3-巖藻糖基乳糖、D-乳糖和L-巖藻糖的參考色譜圖圖B.2高效離子色譜法測定3-巖藻糖基乳糖、D-乳糖和L-巖藻糖的參考色譜圖表B.2高效離子交換色譜條件下各物質(zhì)的保留時間化合物保留時間（min）L-巖藻糖2.83-巖藻糖基乳糖D-乳糖系統(tǒng)溶劑（水）B.3高效液相色譜法測定D-乳糖、L-巖藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖系統(tǒng)適用性試驗參考色譜圖圖B.3高效液相色譜法測定D-乳糖、L-巖藻糖、D-半乳糖和D-葡萄糖系統(tǒng)適用性試驗參考色譜圖表B.3高效液相色譜法測定色譜條件下系統(tǒng)適用性試驗中各物質(zhì)的保留時間化合物保留時間（min）L-巖藻糖D-葡萄糖D-半乳糖7.1D-乳糖3-巖藻糖基乳糖B.4乙醇對照品的參考色譜圖圖B.4乙醇對照品的參考色譜圖表B.4乙醇對照品的保留時間化合物保留時間（min）附錄C用于生產(chǎn)3-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌信息C.1用于生產(chǎn)3-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌信息用于生產(chǎn)3-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌信息見表C.1。表C.1用于生產(chǎn)3-巖藻糖基乳糖的生產(chǎn)菌信息營養(yǎng)強化劑供體3-巖藻糖基乳糖3-fucosyllactose大腸桿菌K-12MG1655EscherichiacoliK-12MG1655螺桿菌(Helicobacterspp.)a大腸桿菌BL21(DE3)EscherichiacoliBL21(DE3)脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)aa為α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶供體。2.中文名稱：乳糖-N-四糖英文名稱：Lacto-N-tetraose，LNT功能分類：食品營養(yǎng)強化劑用量及使用范圍：食品分類號食品名稱使用量備注01.03.02調(diào)制乳粉(僅限兒童用乳粉)0.25-1.82g/L即食狀態(tài)計，粉狀產(chǎn)品按沖調(diào)倍數(shù)折算使用量)當與2’-巖藻糖、低聚果糖、多聚果類物質(zhì)總量64.5g/kg。嬰兒配方食品較大嬰兒和幼兒配方食品特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品質(zhì)量規(guī)格要求干燥等工藝制得的營養(yǎng)強化劑乳糖-N-四糖。乳糖-N-四糖的生產(chǎn)菌應(yīng)經(jīng)過安全性評估并符合附錄C的要求。2化學名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式和相對分子質(zhì)量2.1化學名稱β-D-吡喃半乳糖基-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-吡喃葡萄糖2.2分子式C26H45NO212.3結(jié)構(gòu)式2.4相對分子質(zhì)量707.63（按2022年國際相對原子質(zhì)量）3技術(shù)要求3.1感官要求感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。項目檢驗方法色澤白色至類白色取適量試樣置于清潔、干燥的白瓷盤或燒杯中，在自然光線下觀察其色澤和狀態(tài)。狀態(tài)粉末3.2理化指標理化指標應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2理化指標項目指標檢驗方法w/%≥D-乳糖，w/%≤D-半乳糖和D-葡萄糖，w/%≤其它碳水化合物，w/%≤水分，w/%≤GB5009.3卡爾·費休法灰分，w/%≤GB5009.4殘留蛋白/（mg/kg）≤內(nèi)毒素/（EU/mg）≤0.2GB5009.11鉛（Pb）/（mg/kg）≤0.05GB5009.123.3微生物限量微生物限量應(yīng)符合表3的規(guī)定。表3微生物限量項目指標檢驗方法菌落總數(shù)/（CFU/g）≤500GB4789.2霉菌/（CFU/g）≤GB4789.15酵母/（CFU/g）≤GB4789.15腸桿菌科/（CFU/g）<GB4789.41沙門氏菌/（25g）不得檢出GB4789.4附錄A檢驗方法A.1一般規(guī)定本質(zhì)量規(guī)格要求所用的試劑和水，在未注明其他要求時，均指分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。試驗中所用標準溶液、雜質(zhì)測定用標準溶液、制劑和制品，在未注明其他要求時，均按GB/T601、GB/T602和GB/T603的規(guī)定制備。試驗中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時，均指水溶液。A.2乳糖-N-四糖（以干基計）、D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖的測定A.2.1方法提要試樣溶于水，采用離子色譜法分離，脈沖安培檢測器檢測，以乳糖-N-四糖、D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖對照品的保留時間定性，外標法定量。A.2.2試劑和材料A.2.2.1乳糖-N-四糖對照品（CAS14116-68-8純度≥91%或標明含量的等同物。A.2.2.2D-乳糖對照品（CAS64044-51-5無水乳糖純度≥95%或標明含量的等同物。A.2.2.3乳糖-N-三糖II對照品（CAS75645-27-1）：純度≥95%或標明含量的等同物。A.2.2.4線性乳糖-N-六糖II對照品：純度≥90%或標明含量A.2.2.5D-半乳糖對照品（CAS59-23-4）：純度≥99%或標明含量的等同物。A.2.2.6D-葡萄糖對照品（CAS50-99-7）：純度≥99%或標明含量的等同物。A.2.2.750%氫氧化鈉溶液（NaOH）：色譜純。A.2.2.8氫氧化鈉溶液（500mmol/L取26.0mL50%氫氧化鈉溶液，用水稀釋至1000mL，緩慢搖勻，室溫下可放置A.2.3儀器和設(shè)備A.2.3.1離子色譜儀：配有脈沖安培檢測器，Au工作電極。A.2.3.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。A.2.3.3渦旋混合儀。A.2.3.4超聲波清洗器。A.2.4參考色譜條件A.2.4.1色譜柱：離子交換色譜柱，150mm×3mm（帶保護柱30mm×3mm）或性能相當?shù)碾x子色譜柱。A.2.4.2柱溫：30℃。A.2.4.3洗脫液：A：水；B：氫氧化鈉溶液（500mmoA.2.4.4洗脫類型：梯度洗脫，條件見表A.1。表A.1梯度洗脫條件流速mL/min洗脫液%AB0.4570.45200.45200.457A.2.4.5進樣量：20μL。A.2.4.6檢測器：脈沖安培檢測器。A.2.4.7檢測器溫度：35℃。A.2.4.8數(shù)據(jù)收集速率（Hz）：10。A.2.4.9參比電極：銀/氯化銀電極或其他類似電極。A.2.4.10工作電極：金電極。A.2.5分析步驟A.2.5.1標準儲備溶液的配制A.2.5.1.1乳糖-N-四糖標準儲備液（1000μg/mL）：準確稱取適量乳糖-N-四糖標準品于合適的容量瓶中，加水后搖勻，定容至刻度。A.2.5.1.2D-乳糖標準儲備液（1000μg/mL）：準確稱取適量D-乳糖標準品于合適的容量瓶中，加水后搖勻，定容至刻度。A.2.5.1.3乳糖-N-三糖II標準儲備液（1000μg/mL）：準確稱取適量乳糖-N-三糖II標準品于合適的容量瓶中，加水后搖勻，定容至刻度。A.2.5.1.4線性乳糖-N-六糖II標準儲備液（500μg/mL）：準確稱取適量線性乳糖-N-六糖II標準品于合適的容量瓶中，加水后搖勻，定容至刻度。A.2.5.1.5D-半乳糖標準儲備液（1000μg/mL）：準確稱取適量D-半乳糖標準品于合適的容量瓶中，加水后搖勻，定容至刻度。A.2.5.1.6D-葡萄糖標準儲備液（1000μg/mL）：準確稱取適量D-葡萄糖標準品于合適的容量瓶中，加水后搖勻，定容至刻度。A.2.5.1.7標準混合中間液（約10μg/mL）：分別吸取不同體積的各種儲備液于合適的容量瓶中，加水定容至刻度，得到濃度約為10μg/mL的標準混合中間液。建議的配制過程見表A.2。表A.2標準混合中間液的配制化合物名稱乳糖-N-D-乳糖乳糖-N-D-葡萄糖/D-半乳糖1糖-N-六0.100.100.100.100.201D-半乳糖和D-葡萄糖同時洗脫，并通過組合峰測定。兩個物質(zhì)響應(yīng)基本一致，因此，僅需要D-半乳糖或D-葡萄糖其中一種儲備溶液用于定量。A.2.5.2標準工作溶液配制于10mL容量瓶中加水定容至刻度，得到濃度分別為0.1準工作液。另取適量標準混合中間液，作為濃度為10μg/mL的標準工作液。A.2.5.3試樣制備容量瓶中，用水溶解并定容。取1.0mL該試樣溶液于10mL測定主含量。注：如需要，可調(diào)整試樣的稱樣量或稀釋體積，確保所測濃度在工作曲線的范圍內(nèi)。A.2.5.4系統(tǒng)適應(yīng)性試驗以水為空白樣，連續(xù)進樣至少兩次，進行系統(tǒng)適用性測試。當滿足以下條件時，可進行樣品檢測：——濃度為0.5μg/mL的標準工作液進樣2次后，色譜圖中的乳糖-N-四糖的信噪比應(yīng)≥10；——峰面積的相對偏差應(yīng)不大于10%。如不滿足相對偏差要求，需復測。A.2.5.5測定將標準曲線工作溶液從低到高依次注入離子色譜儀中，測定相應(yīng)的響應(yīng)值（峰面積以標準工作液中各種糖的質(zhì)量濃度為橫坐標，以響應(yīng)值（峰面積）為縱坐標，繪制標準曲線。離子交換色譜條件下乳糖-N-四糖、D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖的對照品溶液參考色譜圖見附錄B.1。將試樣溶液注入離子色譜儀中，記錄色譜圖。根據(jù)保留時間定性，記錄峰面積。根據(jù)標準曲線得到待測液中各種糖的質(zhì)量濃度。同時測定試劑空白。試樣溶液中離子交換色譜條件下乳糖-N-四糖的參考色譜圖見附錄B.2，D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖的參考色譜圖見附錄B.3。A.2.5.6計算試樣中乳糖-N-四糖的含量的質(zhì)量分數(shù)W1按式（A.1）計ρ1——試樣測定液中乳糖-N-四糖的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣的定容體積，單位為毫升（mLf1——乳糖-N-四糖的稀釋因子；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g1000000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；100——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。ω1——試樣中乳糖-N-四糖含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω——按照GB5009.3測得的試樣中水分含量的質(zhì)量分數(shù)，%；100——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。試樣中乳糖-N-三糖II含量的質(zhì)量分數(shù)ω3按式（A.3）計ρ2——試樣測定液中乳糖-N-三糖II的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣的定容體積，單位為毫升（mLf2——乳糖-N-三糖II的稀釋因子；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g1000000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；100——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。試樣中D-乳糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω4按式（A.4）計算：ρ3——試樣測定液中D-乳糖的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣的定容體積，單位為毫升（mLf3——D-乳糖的稀釋因子；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g1000000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；100——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。試樣中線性乳糖-N-六糖II含量的質(zhì)量分數(shù)ω5按式（A.ρ4——試樣測定液中線性乳糖-N-六糖II的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣的定容體積，單位為毫升（mLf4——線性乳糖-N-六糖II的稀釋因子；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g1000000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；100——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。試樣中D-半乳糖和D-葡萄糖含量的質(zhì)量分數(shù)ω6按式（A.6）計算：ρ5——試樣測定液中D-半乳糖和D-葡萄糖的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——試樣的定容體積，單位為毫升（mLf5——D-半乳糖和D-葡萄糖的稀釋因子；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g1000000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)；100——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。本方法的定量限為0.2g/100g。A.3其它碳水化合物的計算其它碳水化合物含量的質(zhì)量分數(shù)ω8按式（A.7）計算：ω1——試樣中乳糖-N-四糖含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω3——試樣中乳糖-N-三糖II含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω4——試樣中D-乳糖含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω5——試樣中線性乳糖-N-六糖II含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω6——試樣中D-半乳糖和D-葡萄糖含量的質(zhì)量分數(shù)，%；ω7——按照GB5009.4測得的試樣中灰分含量的質(zhì)量分數(shù)，%；w——按照GB5009.3測得的試樣中水分含量的質(zhì)量分數(shù)，%；計算結(jié)果保留小數(shù)點后一位。A.4殘留蛋白含量的測定A.4.1方法提要考馬斯亮藍染色試劑與蛋白質(zhì)反應(yīng)，在595nm波長下檢測吸光度用于蛋白質(zhì)測定。為了防止樣品基質(zhì)對顯色反應(yīng)的干擾，樣品溶液與不同濃度的牛血清白蛋白標準溶液混合后顯色，繪制二次標準曲線，計算樣品蛋白質(zhì)含量。A.4.2試劑和材料A.4.2.1牛血清白蛋白對照品：純度≥99%或標明含量的等同A.4.2.2考馬斯亮藍試劑：市售，適用于0.1mg/mL~1.4mg/mL蛋白含量的測定。A.4.3儀器和設(shè)備A.4.3.1紫外-可見分光光度計。A.4.3.2分析天平：感量0.0001g。A.4.4分析步驟A.4.4.1牛血清白蛋白儲備溶液的制備稱取20.0mg牛血清白蛋白對照品于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.2牛血清白蛋白標準溶液的制備取100μL上述儲備溶液于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.3試樣溶液的制備稱取200mg樣品于5mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。A.4.4.4測定按表A.3直接在比色皿中依次加入試樣溶液、水、牛血清白蛋白標準溶液和考馬斯亮藍試劑，混勻，室溫下靜置10min。然后以水作為參比，在595nm波長下依次測定混合溶液的吸光值。表A.3測試試樣溶液制備蛋白濃度（mg/L）牛血清白蛋白標準(μL）考馬斯亮(μL）空白溶液1000200空白溶液2000200混合溶液002000200混合溶液11200混合溶液22200混合溶液340200200A.4.4.5結(jié)果計算以混合溶液的吸光值減去空白吸光值的平均值得到校準吸光值。以校準吸光值為縱坐標，牛血清白蛋白標準溶液濃度為橫坐標，繪制通過橫坐標左半軸交點的二次標準曲線。標準曲線與橫坐標左半軸交點對應(yīng)濃度值的絕對值即為試樣中蛋白的濃度。標準曲線的示意圖見圖A.1。圖A.1蛋白含量測定的標準曲線示意圖試樣中蛋白含量ω9按式（A.8）計算，單位為mg/kg。o9=?x................（A.C1——標準曲線與橫坐標左半軸交點對應(yīng)濃度值，數(shù)值為負值，單位為毫克每升（mg/L-1×C1——通過標準曲線求得的測定混合溶液中蛋白的濃度，單位為毫克每升（mg/LV1——試樣溶液的定容體積，單位為毫升（mLf——稀釋因子；m1——試樣的質(zhì)量，單位毫克（mg0.6——1mL混合溶液中試樣溶液的體積為0.6mL；1000——單位轉(zhuǎn)換系數(shù)。該方法的定量限為17mg/kg。若結(jié)果低于定量限，則結(jié)果表示為＜17mg/kg。結(jié)果保留整數(shù)位。在重復性測定條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不超過其算術(shù)平均值20%。A.5內(nèi)毒素的測定（凝膠法）A.5.1一般規(guī)定本測定所用的水應(yīng)符合滅菌注射用水標準，試驗所用器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、至少30min）去除，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器具。試驗中所用溶液在未注明用何種溶劑配制時，均指水溶液。A.5.2方法提要利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判斷試樣中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)，通過凝膠法進行限度檢測或半定量檢測內(nèi)毒A.5.3試劑和材料A.5.3.1細菌內(nèi)毒素標準品。A.5.3.2鱟試劑：帶有靈敏度標示值λ。A.5.3.3細菌內(nèi)毒素檢查用水：內(nèi)毒素含量＜0.015EU/mL。A.5.4儀器和設(shè)備A.5.4.1旋渦混合器。A.5.4.2恒溫水浴箱。A.5.5分析步驟A.5.5.1試樣溶液配制樣品加細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解。必要時，可調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，一般試樣溶液和鱟試劑混合堿溶液或緩沖液調(diào)節(jié)pH值。酸或堿溶液須用細菌內(nèi)毒素檢查用水在已去除內(nèi)毒素的容器中配制。所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應(yīng)不含內(nèi)毒素和干擾因子。A.5.5.2鱟試劑靈敏度復核試驗在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/mL表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復核試驗。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值(λ),將細菌內(nèi)毒素標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15min或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30s或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作。取不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，分別與等體積的鱟試劑溶液混合，每一個內(nèi)毒素濃度平另外取2管加入等體積的細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對的恒溫水浴箱中，保溫60min±2min。將試管從恒溫水浴箱中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°,若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動，造成假陰性結(jié)果。當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值(λc）按式（A.9）計算，單位為EU/mL。入。=antilg?x/n.......................（A.9）X——為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度；n——為每個濃度的平行管數(shù)。當λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。A.5.5.3干擾試驗按表A.4制備溶液A、B、C和D，使用的試樣溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）是指在試驗中試樣溶液被允許達到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測，MVD按式（A.10）計算：MVD=CL/lc——為試樣溶液的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL如需計算在MVD時的試樣濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；L——試樣的細胞內(nèi)毒素限量，單位為內(nèi)毒素單位每毫克（EU/mgλ——鱟試劑的標示靈敏度，單位為內(nèi)毒素單位每毫升表A.4干擾試驗溶液的制備編號被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無/試樣溶液———2B2λ/試樣溶液試樣溶液12482λλ0.5λ0.25λ4444C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為試樣溶液；B為干擾試驗溶液；C為鱟試劑標示靈敏度對照系列；D為陰性對照。只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗有效。當系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為試樣在該濃度下無干擾作用。其他情況則認為試樣在該濃度下存在干擾作用。若試樣溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將試樣溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再次重復干擾試驗?？赏ㄟ^對試樣進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的試樣溶液進行干擾試驗。當進行樣品的內(nèi)毒素檢查試驗前，須進行干擾試驗。當鱟試劑、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。A.5.5.4測定A.5.5.4.1凝膠限度試驗按表A.5制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)不超過MVD并且已經(jīng)排除干擾的試樣溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。表A.5凝膠限度試驗溶液制備編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/試樣溶液2B2λ/試樣溶液2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水2D無/內(nèi)毒素檢查用水2注：A為試樣溶液；B為試樣陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。保溫60min±2min后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D行管均為陰性，試樣陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定試樣不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定試樣符合規(guī)定，否則判定試樣不符合規(guī)定。若試樣的稀釋倍數(shù)小于MVD而溶液A結(jié)果出現(xiàn)不符合規(guī)定時，可將試樣稀釋至MVD重新實驗，再對結(jié)果進行判A.5.5.4.2凝膠半定量試驗通過確定反應(yīng)終點濃度來量化試樣中內(nèi)毒素的含量。按表A.6制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。表A.6凝膠半定量試驗溶液的制備編號被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的平行管數(shù)A無/試樣溶液檢查用水1248————2222B2λ/試樣溶液—12λ2C2λ/內(nèi)毒素檢查用水檢查用水12482λλ0.5λ0.25λ2222D無/內(nèi)毒素檢查用水———2注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的試樣溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用內(nèi)毒素檢查用水稀釋如1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD；B為含2λ溶度內(nèi)毒素標準品的溶液A（試樣陽性對照C為鱟試劑標示靈敏度對照系列；D為陰性對照。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，試樣陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何A.5.5.5結(jié)果判定系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以λ,為每個系列的反應(yīng)終點濃度。如果檢驗的是經(jīng)稀釋的試樣，則將終點濃度乘以試樣進行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)，即得到每一系列內(nèi)毒素濃度c。若每一系列內(nèi)毒素濃度均小于規(guī)定的限值，判定試樣符合規(guī)定。每一系列內(nèi)毒素濃度的幾何平均值即為試樣溶液的內(nèi)毒素濃度[按公式cg=antilg(Eigc/2)]。若試驗中試樣溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的試樣，則記為小于λ乘以試樣進行半定量試驗若任何系列內(nèi)毒素濃度不小于規(guī)定的限值時，則判定試樣不符合規(guī)定。當試樣溶液的所有平行管均為陽性，可記為內(nèi)毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數(shù)乘以λ。附錄B參考色譜圖B.1乳糖-N-四糖、D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖對照品溶液的參考離子色譜圖圖B.1乳糖-N-四糖、D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖對照品溶液的參考離子色譜圖表B.1色譜條件下各物質(zhì)的參考保留時間化合物保留時間（min）D-半乳糖和D-葡萄糖5.82D-乳糖乳糖-N-三糖II乳糖-N-四糖34.65線性乳糖-N-六糖II41.37B.2試樣溶液中乳糖-N-四糖參考離子色譜圖圖B.2試樣溶液中乳糖-N-四糖參考離子色譜圖B.3試樣溶液中D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖參考離子色譜圖圖B.3試樣溶液中D-乳糖、乳糖-N-三糖II、線性乳糖-N-六糖II、D-半乳糖和D-葡萄糖參考離子色譜圖附錄C用于生產(chǎn)乳糖-N-四糖的生產(chǎn)菌信息C.1用于生產(chǎn)乳糖-N-四糖的生產(chǎn)菌信息用于生產(chǎn)乳糖-N-四糖的生產(chǎn)菌信息見表C.1。表C.1用于生產(chǎn)乳糖-N-四糖的生產(chǎn)菌信息營養(yǎng)強