細(xì)菌鑒定試驗、

涂片染色及接種方法南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院芮勇宇一、細(xì)菌鑒定試驗（一）碳水化合物的代謝試驗（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗（三）各種酶類試驗（四）其他試驗糖發(fā)酵試驗：不同細(xì)菌含有分解不同糖醇類的酶；如發(fā)酵則產(chǎn)酸，使指示劑溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色；如產(chǎn)氣，則液體或半固體培養(yǎng)基產(chǎn)生氣泡，固體培養(yǎng)基可裂開。（一）碳水化合物的代謝試驗氧化發(fā)酵試驗：有氧分解葡萄糖，氧化型；無氧也可分解葡萄糖，發(fā)酵型；不分解葡萄糖，產(chǎn)堿型；通過加石蠟油來制造無氧環(huán)境。（一）碳水化合物的代謝試驗克氏雙糖鐵（KIA）復(fù)合試驗：試管下半部分為葡萄糖，上半部分斜面為乳糖；產(chǎn)酸：用酚紅為指示劑，酸性時為黃色；不產(chǎn)酸：堿性時為紅色；產(chǎn)氣：固體培養(yǎng)基裂開；產(chǎn)H2S：使培養(yǎng)基變黑。（一）碳水化合物的代謝試驗七葉苷水解試驗：原理：將七葉苷分解為葡萄糖和七葉素，七葉素與培養(yǎng)基中枸櫞酸鐵的鐵離子形成黑色的化合物；培養(yǎng)基顏色由黃色變黑褐色?！包S七”。應(yīng)用：用于區(qū)分鏈球菌和腸球菌（D群鏈球菌）。甲基紅試驗：陽性：分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并進(jìn)一步分解成多種酸，使pH值降至4.5以下，加入指示劑為紅色；陰性：分解及產(chǎn)酸少，pH值在6.2以上，加入指示劑不變色；應(yīng)用：大腸埃希菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。V-P試驗：陽性：分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解為乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境下被氧化成二乙酰，與蛋白胨中精氨酸的胍基結(jié)合呈紅色；即培養(yǎng)過夜后加入甲液和乙液為紅色；陰性：加入指示劑不變色；應(yīng)用：與甲基紅試驗結(jié)果相反，大腸埃希菌為陰性，產(chǎn)氣腸桿菌為陽性。吲哚（靛基質(zhì)或蛋白胨水）試驗：陽性：色氨酸酶，分解蛋白胨水中的色氨酸生成吲哚，加入指示劑形成紅色界面；陰性：加入指示劑不變色；區(qū)分普通變形桿菌（+），奇異變形桿菌（-）。（二）蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗?zāi)蛩胤纸庠囼灒宏栃裕耗蛩胤纸饷阜纸饽蛩禺a(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性，加入指示劑為紅色；陰性：加入指示劑不變色。氨基酸脫羧酶試驗：陽性：氨基酸脫羧酶，分解氨基酸生成胺和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，接種后加石蠟油培養(yǎng)過夜，對照管為黃色，陽性為紫色；陰性：對照管為黃色，陰性為黃色。氧化酶試驗：陽性：具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物；細(xì)菌涂于氧化酶紙片上，10秒內(nèi)呈深紫色；陰性：不變色；應(yīng)用：大腸埃希菌為陰性，銅綠假單胞菌為陽性。（三）各種酶類試驗大腸埃希菌氧化酶銅綠假單胞菌氧化酶過氧化氫酶（觸酶）試驗：陽性：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡；陰性：不產(chǎn)生氣泡；應(yīng)用：葡萄球菌和微球菌陽性，鏈球菌和腸球菌陰性。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生兩種血漿凝固酶;結(jié)合凝固酶和游離凝固酶；其他葡萄球菌為陰性；結(jié)合凝固酶，結(jié)合在細(xì)胞壁上，使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，附著于細(xì)菌表面，發(fā)生凝集；利用玻片法，形成凝塊；血漿凝固酶試驗分泌至菌體外的游離凝固酶，可將血漿中的協(xié)同因子激活變?yōu)槟笜游镔|(zhì)，試管法檢測，使試管中的血漿發(fā)生凝固，呈果胨狀；試管法，生理鹽水配制菌懸液；加1/4新鮮人血漿混勻；37℃水浴4小時；兩種凝固酶均起作用，菌少呈大凝塊，菌多呈果胨狀；如果陰性，37℃

孵箱過夜觀察結(jié)果。硝酸鹽還原試驗：陽性：使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，或離子態(tài)的胺，或氮；培養(yǎng)過夜后，滴加甲乙液等量，如出現(xiàn)紅色為陽性；不變色，加入少許鋅粉后仍不變色，也為陽性；陰性：滴加甲乙液等量后不變色，加入少許鋅粉后變色，為陰性。DNA酶試驗：陽性：使長鏈DNA水解成寡核苷酸鏈，用微量生化管培養(yǎng)過夜后，使指示劑變色；卡他布蘭漢為陽性；陰性：奈瑟菌為陰性。枸櫞酸鹽利用試驗：陽性：以胺鹽為唯一氮源，利用枸櫞酸鹽為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，使培養(yǎng)基變堿性，使培養(yǎng)基中溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色；陰性：不變色。（四）其他試驗經(jīng)菌落形態(tài)觀察和革蘭染色證實為陽性球菌后，觸酶試驗陰性；化膿性鏈球菌：桿菌肽敏感，0.04U的桿菌肽藥敏紙片貼于待測菌的平板上，35℃培養(yǎng)過夜，觀察抑菌圈以判斷是否耐藥，化膿性鏈球菌應(yīng)>10mm；鏈球菌手工鑒定經(jīng)菌落形態(tài)觀察和革蘭染色證實為陽性球菌后，觸酶試驗陰性；肺炎鏈球菌：奧撲托辛藥敏紙片敏感，含5μg的該紙片貼于待測菌的平板上，35℃培養(yǎng)過夜，抑菌圈的直徑大于14mm為敏感；鏈球菌手工鑒定無乳鏈球菌：CAMP試驗陽性，該菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌溶血能力；試驗時，先將金黃色葡萄球菌ATCC25923沿血平板直徑劃線接種，再沿該線垂直方向接種鏈球菌，兩線間隔約3-4mm；35℃培養(yǎng)過夜，兩種劃線交界處出現(xiàn)箭頭狀溶血，即為陽性反應(yīng)。鏈球菌手工鑒定氧化發(fā)酵試驗；克氏雙糖鐵（KIA）復(fù)合試驗；氧化酶；觸酶；鏈球菌鑒定試驗。小結(jié)二、涂片染色目的和意義：快速診斷或初步診斷涂片檢查主要種類：1、不染色涂片（non-stained）2、涂片檢查細(xì)菌和真菌，革蘭染色（Gramstain）3、涂片檢查抗酸桿菌，抗酸染色（Anti-faststain）4、查隱球菌，墨汁染色（Indianinknegativestain）糞便常規(guī)檢查，在玻片上加1滴生理鹽水，挑取糞便膿血黏液涂于玻片生理鹽水中；尿常規(guī)檢查，離心后尿沉渣涂于玻片上；上蓋一蓋玻片，在顯微鏡低倍鏡和高倍鏡下觀察，觀察有無細(xì)菌真菌，檢測真菌效果最佳。1、不染色涂片不染色涂片尿沉渣真菌

如果標(biāo)本同時進(jìn)行培養(yǎng)和涂片，則涂片編號按培養(yǎng)編號；如果標(biāo)本只有涂片，則單獨按涂片規(guī)則編號；涂片前應(yīng)在檢驗單、標(biāo)本和玻片上編號，玻片上編號用鉛筆，如果為革蘭染色，在編號下加下劃線；如為抗酸和墨汁染色，則不加下劃線。2、革蘭染色如為中段尿和穿刺液（胸腹水和腦脊液等），高速離心10分鐘；棄上清，將沉渣涂于玻片上；如較多沉渣，可參考血常規(guī)細(xì)胞分類計數(shù)涂片方法，以免太厚。其他標(biāo)本直接用棉簽涂于玻片上，自然晾干，火焰上過3次固定。最好用烘片機烘干及熱固定。38染色后，玻片要自然晾干。臨床標(biāo)本涂片染色后，盡量不用濾紙吸干，以免沾染濾紙上污染菌。最好用烘片機烘干。注意每批玻片和蓋玻片要檢查有無真菌污染。革蘭染色原理G+菌肽聚糖層厚，脂質(zhì)成分少，與結(jié)晶紫緊密結(jié)合；加入乙醇后細(xì)胞壁呈脫水狀態(tài)，可阻止染料由細(xì)胞脫出，不容易被脫色液脫掉。G-菌胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，與染料結(jié)合不緊密；有較多脂多糖、外膜、脂蛋白等含脂類成分，易被乙醇等溶解，使染料脫出細(xì)胞外。G+菌等電點（pI2-3）低于G-菌（pI4-5），在同一pH條件下G+菌帶負(fù)電荷高于G-菌，與帶正電荷的結(jié)晶紫結(jié)合多而牢固，不易脫色；G+菌菌體含有大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，不易被脫色。革蘭陽性菌被染為紫色；革蘭陰性菌被復(fù)染為紅色；真菌同革蘭陽性菌一樣被染為紫色，真菌大于5微米，細(xì)菌小于5微米。不同公司產(chǎn)品染色時間略有不同，使用前需詳細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書；本實驗室用BASO快速革蘭染色液：染液1龍膽紫、乙醇，10s；染液2碘、碘化鉀，10s；染液3丙酮、乙醇，10-20s；染液4沙黃、乙醇，10s；脫色液常先用完，可用丙酮代替，脫色時間稍短些。革蘭染色培養(yǎng)陽性血液涂片痰液痰液G-雙球菌培養(yǎng)陽性血液涂片痰液培養(yǎng)陽性血液涂片據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球每年增加結(jié)核病人約800萬

1000萬，死亡病人約300萬；全人類的三分之一即17億人曾感染過結(jié)核桿菌；結(jié)核病人主要見于發(fā)展中國家，尤其經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)；我國是結(jié)核病高發(fā)國家，廣東地區(qū)發(fā)病率較高。

3、涂片抗酸染色：檢查抗酸桿菌結(jié)核分枝桿菌（TB）菌體表面含有脂質(zhì)成分，不易著色，但一經(jīng)著色后，即使在酸或乙醇的作用下也不容易脫色；本實驗室利用的是改良堿性復(fù)紅法試劑盒，不需要加熱，直接用增強的染色體染色（紅色），然后再用酸及乙醇脫色，再復(fù)染（蘭色），TB仍為紅色，而背景及其它細(xì)菌真菌則為蘭色。

涂片抗酸染色：檢查抗酸桿菌石炭酸復(fù)紅溶液染色5分鐘，不需加溫，也可加溫；水洗，并盡可能將水分瀝干；酸性酒精溶液脫色2分鐘或更久，必須脫干凈，無紅色；水洗，并盡可能將水分瀝干；亞甲基藍(lán)溶液染色30秒，水洗、自然干燥、鏡檢；脫色液常先用完，可自制3%鹽酸酒精溶液作為脫色液。涂片抗酸染色程序鏡檢時，油鏡下仔細(xì)查遍整個涂片或至少100個視野；抗酸性菌呈紅色，其它細(xì)菌及細(xì)胞呈藍(lán)色；TB為細(xì)長，著色不均勻，可2個以上的菌形成V、Y、T等或平行排列等。涂片抗酸染色結(jié)果觀察結(jié)果報告，1984年國內(nèi)統(tǒng)一暫行規(guī)定報告方式：未找到抗酸菌-；找到抗酸桿菌1或2個，全視野發(fā)現(xiàn)1或2個；找到抗酸桿菌+，全視野發(fā)現(xiàn)3-9個；找到抗酸桿菌++，全視野發(fā)現(xiàn)10-99個；找到抗酸桿菌+++，每視野發(fā)現(xiàn)1-9個：找到抗酸桿菌++++，每視野發(fā)現(xiàn)10個以上。

涂片抗酸染色結(jié)果報告新生隱球菌廣泛分布于自然界，也可存在于人體體表、口腔及腸道中；經(jīng)呼吸道侵入人體，由肺經(jīng)血行播散時，可侵犯所有臟器組織，主要侵犯肺、腦及腦膜；好發(fā)于細(xì)胞免疫功能低下者，如AIDS、惡性腫瘤、糖尿病、器官移植及大劑量使用糖皮質(zhì)激素者；臨床上懷疑腦膜炎時，常抽取腦脊液檢查細(xì)菌真菌、抗酸菌、隱球菌。4、墨汁染色查隱球菌腦脊液離心3500r/m，10分鐘；棄上清，沉渣涂片；墨汁染色時，先取一玻片，編號，先滴1滴印度墨汁，再將沉渣涂片，將適量墨汁和沉渣混勻，蓋上蓋玻片；將顯微鏡視野調(diào)暗，先用低倍鏡觀察全片，再用高倍鏡觀察可疑的細(xì)胞；必須找到典型形態(tài)的隱球菌，莢膜清楚，大小不一，有出芽等；非致病性隱球菌無莢膜。墨汁染色新型隱球菌優(yōu)點：快速、價廉，可初步診斷某些病原體；缺點：不能準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌真菌的屬種；缺點：不能準(zhǔn)確指導(dǎo)臨床抗生素治療。細(xì)菌真菌培養(yǎng)鑒定和藥敏試驗。細(xì)菌真菌涂片檢查小結(jié)三、接種方法1、血液

2、尿液

3、糞便

4、痰液

5、咽拭子

6、穿刺液

7、分泌物

8、器械

1、血液1.1靜脈血、骨髓：血液培養(yǎng)瓶可對靜脈血、骨髓或其他無菌性體液進(jìn)行細(xì)菌真菌、厭氧菌培養(yǎng)；細(xì)菌室接收血培養(yǎng)瓶標(biāo)本后，應(yīng)盡快放入血液自動培養(yǎng)及檢測儀器。2、尿液：無菌尿杯用10μl的接種環(huán)取1滿環(huán)，接種血平板進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，連續(xù)劃線半塊平板，用于計數(shù)；另半塊分區(qū)劃線，以培養(yǎng)出單菌落；如有真菌培養(yǎng)，則連續(xù)劃線接種真菌平板（沙保平板和念珠菌選擇性平板）；如檢驗單有抗酸菌培養(yǎng)，可離心后，取沉渣接種羅琴培養(yǎng)基。3、糞便：糞便盒如為膿血、水樣、稀便，則需在檢驗單上注明糞便性狀，如正常則不需注明；培養(yǎng)沙門氏和志賀菌，接種SS培養(yǎng)基；培養(yǎng)弧菌（水樣便），堿性胨水或TCBS選擇平板；培養(yǎng)真菌，真菌培養(yǎng)基。如臨床懷疑菌群失調(diào)，或為膿血、水樣、稀便，則再接種一塊血平板；以上均用金屬接種環(huán)，分4區(qū)劃線，劃下一區(qū)前必須燒接種環(huán)，不能用一次性接種環(huán)。4、痰液：深咳晨痰，痰盒；5、咽拭子：無菌拭子管；痰液、氣管插管、咽拭子；培養(yǎng)的標(biāo)本，接種血平板、嗜血巧克力平板，或真菌平板，接種時用一次性接種環(huán)，分4-5區(qū)劃線，劃下一區(qū)時接種環(huán)可經(jīng)過上一區(qū)約3下；用棉簽取痰液涂第一區(qū)。6、穿刺液（說明標(biāo)本部位）6.1胸水、腹水、腦脊液、關(guān)節(jié)腔液、引流液、腹透液等各部位穿刺液，6、穿刺液（說明標(biāo)本部位）6.2采集容器：無菌拭子管；接種血平板，或真菌平板；同時肉湯增菌，標(biāo)本與肉湯比約1：5~1：10，膽汁標(biāo)本1：10；推薦注射入血液培養(yǎng)瓶上機培養(yǎng)及自動檢測。7、分泌物（說明標(biāo)本部位）7.1前列腺液、尿道、陰道、宮頸口生殖道分泌物；7.2傷口分泌物、膿汁；7.3以上分泌物采集容器：無菌拭子管，可含轉(zhuǎn)運培養(yǎng)基，防止干燥，使苛養(yǎng)菌等可存活24小時。7、分泌物（說明標(biāo)本部位）前列腺液、尿道、陰道、宮頸口等生殖道分泌物：接種血平板，淋球菌平板，或真菌平板；涂片染色檢查細(xì)菌、真菌，淋球菌（只能報告是否查到G-雙球菌）；解脲/人型支原體：按試劑盒說明書操作，同時接種血平板。7、分泌物（說明標(biāo)本部位）傷口分泌物、膿汁：接種血平板，或真菌平板；膿汁同時肉湯增菌；涂片染色檢查細(xì)菌、真菌、抗酸菌。8、器械（說明標(biāo)本部位）8.1氣管插管：無菌拭子管；8.2動靜脈插管、導(dǎo)管、各部位引流管：無菌拭子管；8.3各種輸液反應(yīng)液體，醫(yī)院感染監(jiān)測物品的無菌試驗：直接送檢；8.4空氣監(jiān)測，物表監(jiān)測，醫(yī)護(hù)人員手培養(yǎng)：到細(xì)菌室取培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液。8、器械（說明標(biāo)本部位）動靜脈插管、導(dǎo)管、各部位引流管：取2ml肉湯震蕩混勻，取