鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在某種植物根部細(xì)胞特異性表達(dá)并定位于細(xì)胞質(zhì)膜，具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境中Zn2+的功能。MN為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。甲生物取出基因“剪切”

“拼接”

乙生物表達(dá)

新類型新的生物產(chǎn)品

基因工程：有意識(shí)地把一個(gè)人們所需要的基因轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體中，使后者獲得新的遺傳性狀或表達(dá)所需要產(chǎn)物的技術(shù)。理論基礎(chǔ)原理：基因重組核心：構(gòu)建重組DNA分子優(yōu)點(diǎn)：打破生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。以該植物_________為材料提取________。根DNA不溶于2mol/L二苯胺2.基本原理00.14NaCI濃度（mol/L）DNA溶解度1.DNA粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路：DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在

方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)方法去除其他成分，對(duì)DNA進(jìn)行提取。物理和化學(xué)性質(zhì)冷酒精析出DNADNA的鑒定（沸水浴、二苯胺）取材、研磨紗布過濾取上清液實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取和鑒定必須充分研磨，否則細(xì)胞核不會(huì)充分破碎，釋放出的DNA量就會(huì)減少。過濾時(shí)能否選擇濾紙？濾紙可能會(huì)把DNA分子吸附在濾紙上。預(yù)冷的酒精的優(yōu)點(diǎn)？a.可抑制核酸水解酶的活性，進(jìn)而抑制

；b.抑制分子運(yùn)動(dòng)，使DNA易形成

；c.低溫有利于

。DNA降解沉淀析出增加DNA分子的柔韌性，減少其斷裂玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免加劇DNA分子的斷裂若實(shí)驗(yàn)組顏色不變藍(lán)，可能原因是？各試劑的作用：①研磨液：②體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精：③2mol/L的NaCl溶液：④二苯胺試劑：破壞細(xì)胞，釋放出細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用實(shí)驗(yàn)：DNA的粗提取和鑒定(1)以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100mL血液中需要加入3g檸檬酸鈉，防止

。血液凝固(2)利用動(dòng)物細(xì)胞提取DNA時(shí)動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，可使其

。(3)不能選用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞

。無細(xì)胞核吸水漲破1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序列未知①建立基因組文庫(kù)某生物所有DNA特定的限制酶基因組所有基因每個(gè)基因和載體結(jié)合重組DNA分子導(dǎo)入受體菌基因組文庫(kù)如何在文庫(kù)中獲取目的基因？1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序列未知①建立基因組文庫(kù)如何在文庫(kù)中獲取目的基因？①核酸雜交法放射性特異性探針與之有親緣關(guān)系的生物中分離相關(guān)基因的核酸探針通過功能相同或相近蛋白質(zhì)中的共同氨基酸序列來合成基因探針②根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物篩選目的基因免疫篩選法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物功能活性檢測(cè)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序列未知①建立基因組文庫(kù)浙江高考2019年4月：回答與利用生物技術(shù)培育抗病品種有關(guān)的問題：（1）通過抗病性強(qiáng)的植株獲取抗病目的基因有多種方法。現(xiàn)已獲得純度高的抗病蛋白（可作為抗原），可通過______________技術(shù)獲得特異性探針，并將___________中所有基因進(jìn)行表達(dá)，然后利用該探針，找出能與探針特異性結(jié)合的表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)而獲得與之對(duì)應(yīng)的目的基因。單克隆抗體基因文庫(kù)如果只想研究某些編碼蛋白質(zhì)的DNA序列，基因組文庫(kù)的缺點(diǎn)是什么？非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子12345加工mRNA前體成熟mRNA不能編碼蛋白質(zhì)的序列（內(nèi)含子+非編碼區(qū)序列）

編碼序列=外顯子12345啟動(dòng)子終止子（1）真核生物基因轉(zhuǎn)錄1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。功能：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子：RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)（2）原核生物基因結(jié)構(gòu)終止子：終止轉(zhuǎn)錄1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆?！舅伎?】從基因組文庫(kù)中獲得的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（含內(nèi)含子），若以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到對(duì)應(yīng)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其原因可能是

。胰島素基因含內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達(dá)出鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②建立cDNA基因文庫(kù)1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序列未知②建立cDNA基因文庫(kù)某種生物的成熟mRNA單鏈DNA雙鏈DNA片段（cDNA）導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存cDNA文庫(kù)逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶與載體連接1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序已知①逆轉(zhuǎn)錄法裂解細(xì)胞，抑制RNA酶活性沉淀RNA1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序已知DNA合成儀前提：基因比較小、核苷酸序列已知方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因（將核苷酸按順序一個(gè)一個(gè)連接起來）②化學(xué)合成法1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。目的基因序已知PCR是_______________的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)___________________的原理，在____提供參與DNA復(fù)制的_______與_________，對(duì)____________________進(jìn)行________的技術(shù)；PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因留復(fù)制原理操作環(huán)境目的優(yōu)點(diǎn)：②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1）變性（不需要解旋酶）：當(dāng)溫度上升到_______以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA待擴(kuò)增的DNA片段第一步：變性3’3’5’5’3’5’3’5’變性90℃思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。PCR反應(yīng)的過程1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因2）退火：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

第二步：退火引物1引物2DNA引物3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對(duì)5’5’思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門aq酶不能從0開始添加核苷酸。②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。3’3’PCR反應(yīng)的過程1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因引物是一小段能與__________的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補(bǔ)配對(duì)短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物PCR拓展：引物有什么作用？思考：退火的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？

退火時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低。原因是：①模板鏈一般比較長(zhǎng)，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的

碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)?！揪珳?zhǔn)訓(xùn)練】1.(2021·湖北卷，16)某實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對(duì))外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對(duì))。為了減少反應(yīng)中非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是(

) A.增加模板DNA的量

B.延長(zhǎng)熱變性的時(shí)間 C.延長(zhǎng)延伸的時(shí)間

D.提高退火的溫度

解析

在一定溫度范圍內(nèi)，選擇較高退火溫度可減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，D正確。DPCR拓展：引物設(shè)計(jì)引物對(duì)AP1

AACTGAAATGTAGCTATCP2

TTAAGTCCATTACTCTAG引物對(duì)BS1

GTCCGACTAGTGGCTGTGS2

AGCTGGCGTTTAGCCTCG2.(經(jīng)典真題)PCR過程中退火(復(fù)性)溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來設(shè)定。下表為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，下圖為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖。請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高的退火溫度。________。引物對(duì)序列表引物對(duì)B解析引物對(duì)B中含C與G的堿基對(duì)較多，可采用較高的退火溫度?！髟O(shè)計(jì)兩種引物的要求1：①G+C含量在40%-60%之間，45%-55%最佳

設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如下圖)，請(qǐng)分別說明理由。

(1）第1組：

；

第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效△設(shè)計(jì)兩種引物的要求2：②引物自身不能環(huán)化①兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)③引物長(zhǎng)度不宜過短（用于PCR的引物通常為20~30個(gè)核苷酸），防止引物隨機(jī)結(jié)合(2023·浙江6月選考，19)某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3－GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是(

)A.Gata3基因的啟動(dòng)子無法控制GFP基因的表達(dá)B.翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C.2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3－GFP基因純合子D.若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子B【精準(zhǔn)訓(xùn)練】1.(經(jīng)典真題)為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素。平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為下圖中_________________。引物甲和引物丙解析PCR技術(shù)要求2種引物分別與目的基因的2條單鏈結(jié)合，向相反方向合成子鏈。PCR拓展：引物選擇2.(2023·天津卷，17)基因工程：制備新型酵母菌(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉發(fā)酵，則應(yīng)導(dǎo)入多步分解淀粉所需的多種酶，推測(cè)這些酶生效的場(chǎng)所應(yīng)該是________(填“細(xì)胞內(nèi)”或“細(xì)胞外”)。細(xì)胞外(2)同源切割是一種代替限制酶、DNA連接酶將目的基因?qū)牖虮磉_(dá)載體的方法。當(dāng)目的基因兩側(cè)的小段序列與基因表達(dá)載體上某序列相同時(shí)，就可以發(fā)生同源切割，將目的基因直接插入。研究人員運(yùn)用同源切割的方式，在目的基因兩端加上一組同源序列A、B，已知酵母菌體內(nèi)DNA有許多A－B序列位點(diǎn)可以同源切割插入。構(gòu)建完成的目的基因結(jié)構(gòu)如圖，則應(yīng)選擇圖中的引物________________對(duì)目的基因進(jìn)行PCR。P1和P6(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因(UGA)常用作標(biāo)記基因，又知尿嘧啶可以使5－氟乳清酸轉(zhuǎn)化為對(duì)酵母菌有毒物質(zhì)。ⅰ.導(dǎo)入目的基因的酵母菌應(yīng)在____________的培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)。由于需要導(dǎo)入多種酶基因，需要多次篩選，因此在導(dǎo)入一種目的基因后，要切除UGA基因，再重新導(dǎo)入。研究人員在UGA基因序列兩端加上酵母菌DNA中不存在的同源C.C′序列，以便對(duì)UGA基因進(jìn)行切除。C.C′的序列方向?qū)⒂绊懬懈顣r(shí)同源序列的配對(duì)方式，進(jìn)而決定DNA片段在切割后是否可以順利重連，如圖，則應(yīng)選擇方式________進(jìn)行連接。ⅱ.切去UGA基因的酵母菌應(yīng)在________________的培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)。缺乏尿嘧啶2含有5－氟乳清酸(4)綜上，目的基因、標(biāo)記基因和同源序列在導(dǎo)入酵母菌的基因表達(dá)載體上的排列方式應(yīng)該如圖________。3思考1：為什么溫度要上升至72℃？思考2：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端3）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時(shí)，溶液中的4種____________在耐高溫的_________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脫氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’PCR反應(yīng)的過程1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因思考3：能否用大腸桿菌DNA聚合酶代替Taq酶？PCR過程中需要加熱至90-95℃，所用的DNA聚合酶應(yīng)能耐高溫，而TaqDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性比較強(qiáng)，但大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會(huì)變性失活。思考4：延伸的原料是什么？PCR拓展：實(shí)際原料為dNTP（原料+能量）一：PCR原料dNTPd:脫氧核糖

N：A、T、C、GTP：三個(gè)磷酸原料能量PCR拓展：實(shí)際原料為dNTP（原料+能量）生物化學(xué)家KaryMullis1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶PCR反應(yīng)的條件PCR拓展三：PCR產(chǎn)物分析第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’非目的基因序列目的基因序列引物n代后，①DNA有_____個(gè)

②DNA鏈有_____條③第____代出現(xiàn)完整的目的基因

④共消耗______個(gè)引物⑤共消耗______個(gè)引物A⑥產(chǎn)物有

種

2n2n+132n+1-232n-1巨噬細(xì)胞表面的CD23識(shí)別白色念珠菌(—種真菌)后，其細(xì)胞內(nèi)的一氧化氮合酶被激活，產(chǎn)生一氧化氮，殺滅真菌。研究人員用白色念珠菌感染野生型小鼠和JNK(一種蛋白激酶)基因敲除小鼠，采集了感染前后兩種小鼠血細(xì)胞中的mRNA，利用RT—PCR技術(shù)擴(kuò)增CD23基因，過程和結(jié)果如下圖所示。下列說法正確的是(

)DA.巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞都是具有攝取處理呈遞抗原能力的免疫細(xì)胞B.過程Ⅱ?qū)?個(gè)單鏈cDNA進(jìn)行20次循環(huán)，理論上需要消耗220個(gè)引物BC.野生型和JNK基因敲除組的CD23的數(shù)量和一氧化氮合酶的活性一定不同D.JNK蛋白激酶抑制劑或一氧化氮合酶激活劑可治療白色念珠菌的感染1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR完成后，如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)鑒定？瓊脂糖凝膠電泳1.概念及原理（1）概念帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程（2）原理①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)。在一定的pH下，DNA的磷酸基團(tuán)可以電離出H+，剩下的部分帶負(fù)電荷。1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因與氧自由基之間有一定的排斥作用，減輕自由基對(duì)DNA的損傷。與帶正電荷的組蛋白通過靜電引力結(jié)合形成核小體。維持DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（2）原理①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)。在一定的pH下，DNA的磷酸基團(tuán)可以電離出H+，剩下的部分帶負(fù)電荷。②在電場(chǎng)的作用下，帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)。1.概念及原理（該實(shí)驗(yàn)電泳緩沖液的PH=8）正極負(fù)極1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）概念帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過程（2）原理①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)。在一定的pH下，DNA的磷酸基團(tuán)可以電離出H+，剩下的部分帶負(fù)電荷。②在電場(chǎng)中，帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)?！C合影響（呈負(fù)相關(guān)）瓊脂糖（電泳緩沖液的PH=8）1.概念及原理1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因分子篩③在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。

（2）原理①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)。在一定的pH下，DNA的磷酸基團(tuán)可以電離出H+，剩下的部分帶負(fù)電荷。②在電場(chǎng)的作用下，帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)。1.概念及原理（該實(shí)驗(yàn)電泳緩沖液的PH=8）DNA大→慢

DNA小→快1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（1）材料：PCR擴(kuò)增的DNA片段（2）試劑與儀器：①瓊脂糖凝膠、凝膠載樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)②DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物Maker、核酸染料③電泳槽、電泳緩沖液2.實(shí)驗(yàn)材料1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因維持合適的pH，使溶液具有一定的導(dǎo)電性，利于核酸遷移梳子模具根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配置瓊脂糖溶液，一般配置質(zhì)量體積比為0.8%~1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻。1將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。2待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。3點(diǎn)樣孔電泳槽樣品將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。4將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。5接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為

1～5V/cm2。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。6取出凝膠，置于300nm紫外燈下觀察和照相。73.實(shí)驗(yàn)步驟3.實(shí)驗(yàn)步驟(1)制作瓊脂糖凝膠，將凝膠放入電泳槽中，電泳槽中加入電泳緩沖液。(2)將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液(內(nèi)含指示劑)混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物。(3)接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來設(shè)定電壓，一般為1~5V/cm,待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳。(4)取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相DNA片段根據(jù)長(zhǎng)度大小在凝膠上分開，形成不連續(xù)的條帶，每個(gè)條帶包含的DNA長(zhǎng)度是相同的1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因條帶每條泳道有幾條條帶說明樣品DNA中就有幾種不同大小的DNA分子。條帶的粗細(xì)表示這種DNA分子數(shù)目的多少。4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因①在電泳前將EB與瓊脂糖粉、EDTA緩沖液和水混合以形成凝膠基質(zhì)。EB會(huì)均勻地分散在整個(gè)基質(zhì)中。到凝膠電泳完成時(shí)，每個(gè)DNA分子都吸收了大量的溴化乙錠。在紫外光存在下，EB顯示出熒光。技術(shù)人員會(huì)在凝膠上照射經(jīng)過特殊校準(zhǔn)的紫外線，而機(jī)器會(huì)捕獲發(fā)光碎片的圖像。③當(dāng)凝膠運(yùn)行時(shí)，溴酚藍(lán)與樣品一起遷移，使用戶能夠知道樣品在凝膠中的位置，并防止樣品跑得太遠(yuǎn)而流失到緩沖液中。②具有明顯疏水性的陰離子亞甲基藍(lán)分子的氯化物鹽會(huì)滲透整個(gè)凝膠基質(zhì)。但是，整個(gè)DNA中的氫鍵會(huì)導(dǎo)致染色分子積聚。DNA染色密度的增加會(huì)產(chǎn)生肉眼可見的深藍(lán)色陰影。瓊脂糖凝膠電泳涉及到的幾種染料①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)使用的微量離心管、槍頭和蒸餾

水等在使用前必須進(jìn)行

處理。②每吸取一種試劑后，移液器上的

都必須更換。③電泳時(shí)，DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量越大，受到的阻力越

，遷移速率

越

，DNA分子的相對(duì)分子質(zhì)量越小，受到的阻力越

，遷移速率越

。高壓滅菌槍頭大慢小快5.實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因

若擴(kuò)增不成功，可能的原因有：思考：你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請(qǐng)分析產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的可能原因？

若擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：①引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成引物二聚體；②退火(復(fù)性)溫度過低:③DNA聚合酶的質(zhì)量不好。④Mg2+濃度過高→可能造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加。漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。②利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳技術(shù)：分離、鑒定、純化核酸和蛋白質(zhì)的常用方法內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的酶D催化甘油二酯合成甘油三酯（脂肪）。研究者利用正常小鼠和酶D含量降低50%的突變小鼠A，分別提取兩組小鼠肝細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)細(xì)胞不同部位酶P的含量（電泳條帶顏色越深，蛋白質(zhì)含量越高），結(jié)果如圖。根據(jù)電泳結(jié)果推測(cè)，甘油二酯可以

。誘導(dǎo)酶P從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。根據(jù)序列信息設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR每個(gè)循環(huán)第一步是進(jìn)行熱變性處理，該處理的效果類似于生物體內(nèi)___________的作用效果。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，DNA分子因?yàn)楹琠_______而帶負(fù)電荷，凝膠點(diǎn)樣孔端應(yīng)靠近電泳槽負(fù)極接口；當(dāng)2個(gè)PCR產(chǎn)物分子量接近時(shí)，若延長(zhǎng)電泳時(shí)間，凝膠中這2個(gè)條帶之間的距離會(huì)_______?；厥誅NA片段，連接至克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序驗(yàn)證。1、獲取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因M、N并克隆。解旋酶磷酸基團(tuán)變長(zhǎng)為什么一定要連接載體？載體能提供什么？質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。載體質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動(dòng)植物病毒等。真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。

（1）結(jié)構(gòu)（理想載體）標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。能自主復(fù)制限制酶切割位點(diǎn)為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。2、重組表達(dá)載體構(gòu)建。分別將含M、N基因的重組質(zhì)粒和酵母表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切處理，然后利用___________連接。DNA連接酶表達(dá)載體①穩(wěn)定存在不降解②自我復(fù)制能遺傳③基因表達(dá)原核細(xì)胞：環(huán)狀DNA真核細(xì)胞：整合到基因組上復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子和終止子2、重組表達(dá)載體構(gòu)建?；蚬こ痰墓ぞ摺d體（2）基因表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)2、重組表達(dá)載體構(gòu)建?；蚬こ痰墓ぞ摺d體啟動(dòng)子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。終止子：一段特殊DNA序列，位于基因的下游，終止轉(zhuǎn)錄。供重組DNA分子的篩選DNA復(fù)制所需結(jié)構(gòu)目的基因：編碼蛋白質(zhì)的基因或具有調(diào)控作用的因子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：構(gòu)建乳腺生物反應(yīng)器的表達(dá)載體時(shí),重組表達(dá)載體中需含有在乳腺中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子,以便目的基因在乳腺中特異性表達(dá),從而可在動(dòng)物的乳汁中獲得目的蛋白。（3）標(biāo)記基因的原理①原核生物：抗生素抗性基因a.抗生素：殺死細(xì)菌，如青霉素、四環(huán)素b.抗生素抗性基因：抵抗殺滅作用，抗藥基因②真核生物：熒光基因2、重組表達(dá)載體構(gòu)建。基因工程的工具——載體要想構(gòu)建重組表達(dá)載體，需要什么工具？主要來自原核生物數(shù)千種▲限制酶不是一種酶，而是一類酶。來源種類特點(diǎn)GAATTCCTTAAG能識(shí)別雙鏈

DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”酶的專一性2、重組表達(dá)載體構(gòu)建。基因工程的工具——限制性內(nèi)切核酸酶

②限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？

①原核生物中存在限制酶的意義是什么？原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保證自身安全，防止外來病原物的危害。原核生物DNA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。2、重組表達(dá)載體構(gòu)建。基因工程的工具——限制性內(nèi)切核酸酶結(jié)果產(chǎn)生黏性末端或平末端GAATTCCTTAAG作用部位識(shí)別序列長(zhǎng)度特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵大多數(shù)是6個(gè)核苷酸序列磷酸二酯鍵2、重組表達(dá)載體構(gòu)建?；蚬こ痰墓ぞ摺拗菩詢?nèi)切核酸酶EcoRⅠ中軸線粘性末端平末端SamⅠAATT*形成的黏性末端（從5’往3’讀）為_____AATT注意①能被限制性酶特異性識(shí)別的切割位點(diǎn)一般都具有回文序列：即在切割位點(diǎn)，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條反向讀的堿基序列完全一致。②在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內(nèi)切酶切割，會(huì)產(chǎn)生4個(gè)末端?！緳z測(cè)1】：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ________EcoRⅠ________HindⅢ________BglⅡ________GATCAATTAGCTGATC思考：同種限制酶切割的黏性末端一定相同嗎？不同種限制酶切出的黏性末端一定不同嗎？一定相同,不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端（5）識(shí)別序列③拓展三：同裂酶/異裂酶/同尾酶同裂酶：識(shí)別相同的序列，產(chǎn)生相同的黏性末端（緩沖體系不同：T/PH）異裂酶：識(shí)別相同的序列，產(chǎn)生不同末端同尾酶：識(shí)別不同(等長(zhǎng)/不等長(zhǎng))的序列，產(chǎn)生相同的黏性末端。2、重組表達(dá)載體構(gòu)建?；蚬こ痰墓ぞ摺拗菩詢?nèi)切核酸酶(2023·重慶卷，12)某小組通過PCR(假設(shè)引物長(zhǎng)度為8個(gè)堿基，短于實(shí)際長(zhǎng)度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進(jìn)行酶切(如下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達(dá)載體。下列敘述錯(cuò)誤的是(

)BA.實(shí)驗(yàn)所用引物，其中一個(gè)序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對(duì)載體進(jìn)行酶切至少獲得了2個(gè)片段D.酶切片段和載體連接時(shí)可使用E.coli連接酶或T4連接酶作用：將雙鏈DNA雙鏈片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

。E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶從大腸桿菌中分離得到只能連接互補(bǔ)黏性末端從T4噬菌體中分離得到黏性末端與平末端均可連接，但連接平末端的效率相對(duì)比較低。種類作用部位DNA連接酶2、重組表達(dá)載體構(gòu)建?；蚬こ痰墓ぞ摺狣NA連接酶相同點(diǎn)：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶不同點(diǎn)：DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板；DNA連接酶連接的是DNA片段，不需要模板

思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？酶種類作用底物作用部位作用結(jié)果限制酶DNA分子DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA聚合酶磷酸二酯鍵解旋酶DNA分子DNA水解酶DNA分子磷酸二酯鍵DNA分子片段脫氧核苷酸堿基對(duì)中的氫鍵磷酸二酯鍵DNA相關(guān)酶總結(jié)（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，能否用SmaⅠ限制酶切割質(zhì)粒？為什么？不能因?yàn)镾maⅠ切割會(huì)破壞質(zhì)粒的抗生素抗性基因。質(zhì)粒上的抗性基因是標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選。若被破壞，無法進(jìn)一步篩選。思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，如何避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）？限制性內(nèi)切核酸酶的選擇（2）只使用EcoRⅠ分別切割質(zhì)粒和外源DNA，能否構(gòu)建基因表達(dá)載體？有何弊端？能①質(zhì)粒、目的基因會(huì)發(fā)生自身環(huán)化連接；②會(huì)發(fā)生兩兩自身連接；③質(zhì)粒與目的基因會(huì)發(fā)生反向連接。思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，如何避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）？限制性內(nèi)切核酸酶的選擇①單酶切法載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接反向連接11’11’111’1’11’11’正向連接限制性內(nèi)切核酸酶的選擇轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可能不同（3）與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)是什么？①可以防止質(zhì)粒、目的基因的自身環(huán)化連接；②還可以防止目的基因與載體的反向連接。思考：構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中，如何避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接（保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接）？限制性內(nèi)切核酸酶的選擇載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接反向連接ABAB正向連接②雙酶切法限制性內(nèi)切核酸酶的選擇（1）不破壞目的基因原則（2）保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則（3）確保出現(xiàn)相同黏性末端原則（4）保證目的基因和質(zhì)粒發(fā)生定向連接（正向連接，前后有啟動(dòng)子和終止子）限制性內(nèi)切核酸酶的選擇為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。2、重組表達(dá)載體構(gòu)建。將得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用PCR快速驗(yàn)證重組轉(zhuǎn)化是否成功。此反應(yīng)可以用大腸桿菌懸液當(dāng)模板的原因是____________________________________________________________________。熱變性使大腸桿菌細(xì)胞破裂，DNA流出。(2024·浙南聯(lián)盟)科研人員為生產(chǎn)SSB抗體的檢測(cè)試劑，利用基因工程獲得重組SSB蛋白。流程如下，請(qǐng)回答：注：Xho

Ⅰ、BamHⅠ、EcoRⅠ表示限制酶，kanr、cat分別表示卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因。（1）獲得含SSB基因的重組質(zhì)粒后，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)切割原質(zhì)粒和重組質(zhì)粒，獲得片段大小如下表(1kb＝1000堿基對(duì))，分析數(shù)據(jù)，計(jì)算可得SSB基因的長(zhǎng)度為________。限制酶EcoRⅠBamHⅠ和XhoⅠ原質(zhì)粒8.1kb2.7kb、5.4kb重組質(zhì)粒3.4kb、5.0kb未做該處理3kb(2)②過程目的是將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到處于________的大腸桿菌內(nèi)，并接種于添加________的培養(yǎng)基上，收集菌落進(jìn)行鑒定，將陽(yáng)性菌落進(jìn)一步純化后將菌體破碎處理，篩選得到重組SSB蛋白。感受態(tài)卡那霉素為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。3、酵母菌轉(zhuǎn)化。取凍存的鋅吸收缺陷型酵母菌株，直接在固體培養(yǎng)基進(jìn)行_________培養(yǎng)，活化后接種至液體培養(yǎng)基，采用________以擴(kuò)大菌體數(shù)量，用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母菌。劃線振蕩培養(yǎng)將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即獲得純而壯的、活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物用PEG/LiAc處理的感受態(tài)酵母菌利用帶有正電荷的鋰離子中和細(xì)胞壁和質(zhì)粒上的負(fù)電荷，轉(zhuǎn)化混合物中的單鏈DNA將結(jié)合在細(xì)胞壁上。然后利用突然增溫造成細(xì)胞內(nèi)外壓力差，在細(xì)胞壁上形成小孔讓質(zhì)粒進(jìn)入。一旦溫度降下來，酵母細(xì)胞壁恢復(fù)，轉(zhuǎn)化即可完成。PEG可減少醋酸鋰對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的過度損傷，同時(shí)能夠使質(zhì)粒與細(xì)胞膜的接觸更為緊密。那其他微生物如何變成感受態(tài)呢？（1）常用方法：Ca2+處理原核細(xì)胞（常選擇大腸桿菌）（2）受體細(xì)胞：Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收1、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞使用Ca2+處理：增加細(xì)胞壁的通透性，可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)（感受態(tài)細(xì)胞）。低溫低濃度Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞低溫下表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合短暫熱刺激感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子【注意】原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。（因?yàn)闆]有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)一步加工。）3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化①花粉管通道法（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）方法2：在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入胚囊。方法1：用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因適用生物：開花植物2、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。實(shí)質(zhì)是基因重組。農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物,對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。2、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化目的基因Ti質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌植物細(xì)胞植物細(xì)胞染色體DNA新性狀植株構(gòu)建轉(zhuǎn)入導(dǎo)入插入表達(dá)c.過程：2、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化該過程經(jīng)過____次拼接、____次導(dǎo)入①第一次拼接：_______________________________②第二次拼接：

______________________________________________________________③第一次導(dǎo)入：__________________________________④第二次導(dǎo)入：__________________________________將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上農(nóng)桿菌將插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上（非人工操作）兩兩將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌將含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞（非人工操作）2、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化（2021.1浙江選考）（二）三葉青為蔓生的藤本植物，以根入藥。由于野生三葉青對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求非?？量蹋约吧鷳B(tài)環(huán)境的破壞和過度的采挖，目前我國(guó)野生三葉青已十分珍稀。（1）為保護(hù)三葉青的________多樣性和保證藥材的品質(zhì)，科技工作者依據(jù)生態(tài)工程原理，利用________技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了三葉青的林下種植。（2）依據(jù)基因工程原理，利用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染三葉青帶傷口的葉片，葉片產(chǎn)生酚類化合物，誘導(dǎo)發(fā)根農(nóng)桿菌質(zhì)粒上vir系列基因表達(dá)形成________和限制性核酸內(nèi)切酶等，進(jìn)而從質(zhì)粒上復(fù)制并切割出一段可轉(zhuǎn)移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA進(jìn)入葉片細(xì)胞并整合到染色體上，T-DNA上rol系列基因表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)的植物激素，促使葉片細(xì)胞持續(xù)不斷地分裂形成________，再分化形成毛狀根。（3）剪取毛狀根，轉(zhuǎn)入含頭孢類抗生素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行多次________培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加抗生素的主要目的是_______________。最后取毛狀根轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基、置于搖床上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，通過控制搖床的________和溫度，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基成分中的_____________________________________，獲得大量毛狀根，用于提取藥用成分。遺傳間種DNA聚合酶愈傷組織繼代殺滅發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)速營(yíng)養(yǎng)元素以及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度（2022.6浙江選考）（二）回答與植物轉(zhuǎn)基因和植物克隆有關(guān)的問題：(4)在用農(nóng)桿菌侵染的方法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因過程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生長(zhǎng)，二是篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)選擇培養(yǎng)基中抗生素濃度___________時(shí)，通常會(huì)出現(xiàn)較多假陽(yáng)性植株，因此在轉(zhuǎn)基因前需要對(duì)受體進(jìn)行抗生素的___________檢測(cè)。(5)為提高培育轉(zhuǎn)基因植株的成功率，植物轉(zhuǎn)基因受體需具有較強(qiáng)的___________能力和遺傳穩(wěn)定性。對(duì)培養(yǎng)的受體細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性的早期檢測(cè)，可通過觀察細(xì)胞內(nèi)___________形態(tài)是否改變進(jìn)行判斷，也可通過觀察分裂期染色體的___________，分析染色體組型是否改變進(jìn)行判斷。(6)植物轉(zhuǎn)基因受體全能性表達(dá)程度的高低主要與受體的基因型、培養(yǎng)環(huán)境、繼代次數(shù)和___________長(zhǎng)短等有關(guān)。同時(shí)也與受體的取材有關(guān)，其中受體為___________時(shí)全能性表達(dá)能力最高。農(nóng)桿菌過低敏感性再生細(xì)胞核形態(tài)特征和數(shù)量培養(yǎng)時(shí)間受精卵③基因槍法①原理：將表達(dá)載體DNA包裹在金屬顆粒表面，直接通過氣壓轟入受體細(xì)胞。②優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)巫尤~植物常用③缺點(diǎn)：成本昂貴2、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化受精卵構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物受體細(xì)胞：

過程：為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？①

體積大，易操作。②

全能性高，易培養(yǎng)成完整個(gè)體?？梢詫⒛康幕?qū)雱?dòng)物體細(xì)胞嗎？顯微注射法3、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞?！D(zhuǎn)化其他方法：腺病毒3、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。——轉(zhuǎn)化為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。檢測(cè)M、N基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)水平，無顯著差異。M、N基因mRNA鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酵母菌PCR等技術(shù)檢測(cè)抗原—抗體雜交技術(shù)鋅吸收鑒定（個(gè)體水平）分子水平導(dǎo)入受體細(xì)胞培養(yǎng)加入氨芐青霉素只有含有載體的大腸桿菌才能存活并增殖含有氨芐青霉素抗性基因載體（如質(zhì)粒）（1）目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接目的基因與質(zhì)粒連接實(shí)質(zhì)：檢測(cè)載體是否成功導(dǎo)入4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。方法一：瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)+PCR技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物提取DNA酶切DNA作為模板設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增是否擴(kuò)增出目的基因電泳檢測(cè)M（marker）1-標(biāo)準(zhǔn)樣品；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)M、N品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（1）重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。目的基因是否成功導(dǎo)入方法二：核酸(DNA)雜交+PCR技術(shù)(1)重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞①制作出與目的基因序列互補(bǔ)的有同位素標(biāo)記的DNA片段（基因探針），并用PCR擴(kuò)增探針。②提取受體細(xì)胞全部DNA，然后酶切→電泳→堿變性處理DNA→轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上固定→加入探針雜交③洗膜→放射性自顯影→觀察有無雜交帶4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。

思考：DNA分子雜交檢測(cè)目的基因的原理是什么？堿基互補(bǔ)配對(duì)原則目的基因是否成功導(dǎo)入遺傳表型直接篩選法LacZ’基因的藍(lán)白斑篩選4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。(1)重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞——藍(lán)白斑篩選目的基因是否成功導(dǎo)入印章（接種工具）滅菌過的結(jié)果：從相應(yīng)位置的母平板上篩選出待測(cè)的突變型菌落。氨芐青霉素培養(yǎng)基四環(huán)素培養(yǎng)基4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。(1)重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞——影印法目的基因插入到Tetr中目的基因是否成功導(dǎo)入篩選方法：①將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌放在含青霉素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長(zhǎng)的是含重組質(zhì)粒的細(xì)菌、含質(zhì)粒的細(xì)菌和含質(zhì)?！|(zhì)粒的細(xì)菌，如圖1、2、3、4、5菌落；②再利用滅菌的絨布影印到含四環(huán)素培養(yǎng)基上③最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進(jìn)行培養(yǎng)。4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。(1)重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入受體細(xì)胞——影印法目的基因是否成功導(dǎo)入(2)目的基因是否轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)基因生物PCR操作是否擴(kuò)增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA提取RNAmRNA作為模板方法一：逆轉(zhuǎn)錄+PCR技術(shù)+瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測(cè)提取轉(zhuǎn)基因生物的全部RNA制作基因探針，并用PCR擴(kuò)增變性15N15N雜交分子（可檢測(cè)）方法二：核酸(DNA+RNA)雜交+PCR技術(shù)4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。（3）檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)植物根提取鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取抗原抗體雜交——通過抗原-抗體雜交檢測(cè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白蛋白4.目的基因的檢測(cè)和鑒定4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒(菌)感染(抗病接種實(shí)驗(yàn))未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)（4）個(gè)體生物學(xué)水平鑒定4.目的基因的檢測(cè)和鑒定①檢測(cè)生物是否具有該蛋白質(zhì)賦予的某種特性以及具有該特性的程度。②活性比較實(shí)驗(yàn):將基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能進(jìn)行活性比較，以確定功能活性是否相同。為研究該植物根部細(xì)胞2種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N與吸收Z(yǔ)n2+相關(guān)的生物學(xué)功能，在克隆M、N基因基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化鋅吸收缺陷型酵母，進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定。4、檢測(cè)目的基因及其表達(dá)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)基因酵母功能鑒定。分別將轉(zhuǎn)化了M、N基因的酵母菌株于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6。將菌液用___________法逐級(jí)稀釋至OD600為0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天，菌落生長(zhǎng)如圖。該實(shí)驗(yàn)中陰性對(duì)照為_______________________________。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步推測(cè)：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白M和N中，轉(zhuǎn)運(yùn)Zn2+能力更強(qiáng)的是____________，依據(jù)是_____________________________________。梯度稀釋鋅吸收缺陷型酵母+空載體N轉(zhuǎn)入N基因的這組酵母菌數(shù)量多1.(2020·浙江7月選考，24)下列關(guān)于基因工程的敘述，正確的是(

)A.若受體大腸桿菌含有構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)用到的限制性內(nèi)切核酸酶，則一定有利于該重組質(zhì)粒進(jìn)入受體并保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定B.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某抗鹽植物獲得2個(gè)穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因品系，抗性鑒定為抗除草劑抗鹽和抗除草劑不抗鹽。表明一定是抗鹽性的改變與抗除草劑基因的轉(zhuǎn)入無關(guān)C.抗除草劑基因轉(zhuǎn)入某植物獲得轉(zhuǎn)基因植株，其DNA檢測(cè)均含目的基因，抗性鑒定為抗除草劑和不抗除草劑。表明一定是前者表達(dá)了抗性蛋白而后者只表達(dá)抗性基因RNAD.已知不同分子量DNA可分開成不同條帶，相同分子量的為一條帶。用某種限制性內(nèi)切核酸酶完全酶切環(huán)狀質(zhì)粒后，出現(xiàn)3條帶。表明該質(zhì)粒上一定至少有3個(gè)被該酶切開的位置D2.(2024·浙江1月選考，23)小鼠毛囊中表達(dá)F蛋白。為研究F蛋白在毛發(fā)生長(zhǎng)中的作用,利用基因工程技術(shù)獲得了F基因敲除的突變型純合體小鼠，簡(jiǎn)稱f小鼠,突變基因用f表示。f小鼠皮毛比野生型小鼠長(zhǎng)50%，表現(xiàn)出毛絨絨的樣子,其他表型正常。(注：野生型基因用＋＋表示；f雜合子基因型用＋f表示)回答以下問題： (1)F基因敲除方案如圖甲。在F基因的編碼區(qū)插入了一個(gè)DNA片段P，引起F基因產(chǎn)生_______________________，導(dǎo)致mRNA提前出現(xiàn)終止密碼子，使得合成的蛋白質(zhì)因?yàn)槿笔Я瞬糠謃_____________而喪失活性。要達(dá)到此目的，還可以對(duì)該基因特定堿基進(jìn)行________和________。編碼序列錯(cuò)位(或基因突變)氨基酸序列替換缺失(2)從野生型、f雜合子和f小鼠組織中分別提取DNA，用限制酶HindⅢ酶切，進(jìn)行瓊脂糖電泳，用DNA探針檢測(cè)。探針的結(jié)合位置如圖甲，檢測(cè)結(jié)果如圖乙，則f小鼠和f雜合子對(duì)應(yīng)的DNA片段分別位于第________泳道和第________泳道。32(3)g小鼠是長(zhǎng)毛隱性突變體(gg)，表型與f小鼠相同。f基因和g基因位于同一條常染色體上。f雜合子小鼠與g小鼠雜交，若雜交結(jié)果是______________________，則g和f是非等位基因；若雜交結(jié)果是_______________________________，則g和f是等位基因。(注：不考慮交叉互換；野生型基因用＋＋表示；g雜合子基因型用＋g表示)子代全部野生型/短毛野生型(短毛)∶突變型(長(zhǎng)毛)＝1∶1(4)確定g和f為等位基因后，為進(jìn)一步鑒定g基因，分別提取野生型(＋＋)、g雜合子(＋g)和g小鼠(gg)的mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后用(2)小題同樣的DNA探針和方法檢測(cè)，結(jié)果如圖丙。g小鼠泳道沒有條帶的原因是_______________________________________________________________________。組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)野生型和g雜合子表達(dá)F蛋白，g小鼠不表達(dá)F蛋白，因此推測(cè)F蛋白具有的作用