PCR技術(shù)的應(yīng)用2019人教版選擇性必修三二輪復(fù)習(xí)專題課件1.全稱：

；

2.原理：

；3.條件：①緩沖液：含有

，目的是

；②模板：DNA雙鏈；③原料：4種

，既作為

又作為

；④酶：

的

酶；⑤引物：

種，使DNA聚合酶能從引物的

端開始連接脫氧核苷酸。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)半保留復(fù)制Mg2+激活DNA聚合酶脫氧核苷酸（dNTP)

原料能量耐高溫DNA聚合23’PCR基礎(chǔ)知識(shí)回顧PCR技術(shù)的應(yīng)用1、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR)2、實(shí)時(shí)PCR（real－timePCR）3、添加限制酶切位點(diǎn)5.重疊延伸PCR8.反向PCR4.基因融合6.大引物PCR7.巢式PCR9.DNA測序10.不對稱PCR技術(shù)RT－PCR即逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，利用引物和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。RT－PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能，某些病毒的核酸檢測就是依據(jù)此原理。PCR技術(shù)的應(yīng)用1、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR)對點(diǎn)訓(xùn)練1.RT－PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，可利用此技術(shù)獲取目的基因，具體過程如圖所示，以下說法錯(cuò)誤的是

(

)A.

設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)需考慮表達(dá)載體的序列B.

GC含量高的引物在與模板鏈結(jié)合時(shí)，需要更高的溫度C.

過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、Taq酶和引物A等D.

過程Ⅱ擬對單鏈cDNA進(jìn)行n次循環(huán)的擴(kuò)增，理論上需要2n－1個(gè)引物BC過程Ⅰ是逆轉(zhuǎn)錄過程，所以需要加入緩沖液、原料、逆轉(zhuǎn)錄酶酶和引物A等實(shí)時(shí)PCR（real－timePCR）是一種定量測定樣品中特定DNA片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（如圖所示）。反應(yīng)中一般使用帶有熒光標(biāo)記的PCR引物，從而能夠通過熒光監(jiān)測每次PCR循環(huán)后擴(kuò)增所得的產(chǎn)物的量。通過連續(xù)監(jiān)測下獲得的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線，可推導(dǎo)出樣品中模板DNA的初始含量。PCR技術(shù)的應(yīng)用2、實(shí)時(shí)PCR（real－timePCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡稱qPCR，靈敏度高特異性好，是目前檢測微小殘留病變的常用方法。將標(biāo)有熒光素的Taqman探針與待測樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測樣本DNA配對結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光(如圖所示)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，通過實(shí)時(shí)檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(該值與待測樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān))。下列有關(guān)敘述正確的是()A．每個(gè)模板DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)B．做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成1種引物和1種Taqman探針C．在反應(yīng)過程中，需要細(xì)胞中的ATP為新鏈的合成提供能量D．熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明含有的病變的概率越小對點(diǎn)訓(xùn)練A無需ATP2種越大PCR技術(shù)的應(yīng)用3、添加限制酶切位點(diǎn)PCR技術(shù)中，在上游引物的5'端可以加入限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，以便后續(xù)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序等操作1.（2024·河北邢臺(tái)模擬）PCR引物的3′端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5′端無嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列。下列敘述正確的是（）A．PCR第5個(gè)循環(huán)，消耗了16對引物B．脫氧核苷酸作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到5′端C．PCR反應(yīng)體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、Ca2＋等D．用圖中引物擴(kuò)增至少四個(gè)循環(huán)后才能獲得兩端均添加限制酶切點(diǎn)的目的產(chǎn)物對點(diǎn)訓(xùn)練A3′Mg2＋兩個(gè)循環(huán)對點(diǎn)訓(xùn)練對點(diǎn)訓(xùn)練PCR技術(shù)的應(yīng)用4.基因融合PCR技術(shù)的應(yīng)用4.基因融合對點(diǎn)訓(xùn)練PCR技術(shù)的應(yīng)用5.重疊延伸PCR重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過程如圖所示(凸起處代表突變位點(diǎn))。引物A引物B引物C引物DPCR1PCR2PCR3PCR4圖2所示的4次PCR應(yīng)該分別如何選擇圖1中所示的引物？請?zhí)顚懸韵卤砀瘢ㄈ暨x用該引物劃“√”，若選用該引物劃“×”）√√××××√√××××√××√對點(diǎn)訓(xùn)練大引物PCR需要用到三條引物進(jìn)行兩輪PCR。第一輪PCR利用突變上游引物和常規(guī)下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到不完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段；第二輪PCR利用第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物中的一條DNA鏈作為下游大引物，它與常規(guī)上游引物一起擴(kuò)增得到完整的含有突變位點(diǎn)的DNA片段。PCR技術(shù)的應(yīng)用6.大引物PCR①預(yù)期蛋白質(zhì)的功能②設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)③推測應(yīng)有的氨基酸序列④找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因⑤獲得所需蛋白質(zhì)天然胰島素B鏈部分氨基酸序列：酪氨酸蘇氨酸脯氨酸賴氨酸蘇氨酸設(shè)計(jì)后胰島素B鏈部分氨基酸序列：B28B29酪氨酸蘇氨酸賴氨酸脯氨酸蘇氨酸B28B29mRNAmRNA翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄天然胰島素對應(yīng)的部分基因：改造后應(yīng)得到的基因序列：轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的應(yīng)用6.大引物PCR天然胰島素B鏈部分氨基酸序列：酪氨酸蘇氨酸脯氨酸賴氨酸蘇氨酸設(shè)計(jì)后胰島素B鏈部分氨基酸序列：B28B29酪氨酸蘇氨酸賴氨酸脯氨酸蘇氨酸B28B29mRNAmRNA翻譯翻譯轉(zhuǎn)錄天然胰島素對應(yīng)的部分基因：改造后應(yīng)得到的基因序列：轉(zhuǎn)錄待突變位點(diǎn)常規(guī)下游引物突變上游引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物作為下一輪PCR的大引物天然胰島素對應(yīng)的部分基因：待突變位點(diǎn)常規(guī)下游引物突變上游引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物作為下一輪PCR的大引物進(jìn)行PCR待突變位點(diǎn)下游大引物常規(guī)上游引物天然胰島素對應(yīng)的部分基因：待突變位點(diǎn)常規(guī)下游引物突變上游引物進(jìn)行PCR產(chǎn)物作為下一輪PCR的大引物進(jìn)行PCR待突變位點(diǎn)下游大引物常規(guī)上游引物進(jìn)行PCR天然胰島素對應(yīng)的部分基因：待突變位點(diǎn)PCR合成的人胰島素突變基因1.（2023·山東高考節(jié)選）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測，若僅用一對引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物

。

F2和R1或

F1與R2對點(diǎn)訓(xùn)練2、重組PCR技術(shù)是一項(xiàng)新的PCR技術(shù)，可將來兩個(gè)不相關(guān)的DNA連接起來，組成一個(gè)新的分子。實(shí)驗(yàn)小組從豬源大腸桿菌中擴(kuò)增得到LTB基因和ST1基因片段，用重組PCR技術(shù)構(gòu)建了LTB-ST融合基因。融合基因的制備過程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}:對點(diǎn)訓(xùn)練(1)設(shè)計(jì)引物時(shí)，引物P1與引物P2的堿基序列

(填“能”或“不能”)互補(bǔ);引物P2與引物P3的堿基序列

(填“能”或“不能”)部分互補(bǔ)，原因是

。

不能能使LTB基因與ST1基因的單鏈融合在一起(2)從P2，P3兩種引物的角度分析，LTB和ST1基因能夠融合的關(guān)鍵是PCR1和PCR2不能在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行，原因是：

。引物之間的結(jié)合會(huì)干擾引物和模板鏈的結(jié)合，從而影響PCR過程能(4)雜交鏈延伸生成LTB-ST1融合基因的過程

(填“需要”或“不需要”)加入引物。在圖標(biāo)出雜交鏈兩條母鏈的3'端和5'端。(3)DNA子鏈?zhǔn)菑?'端向3'端延伸。為了使雜交鏈順利延伸子鏈，至少需要經(jīng)過2次循環(huán)才能得到用于雜交的目的鏈L、S，則第2次循環(huán)的目的是

。為雜交鏈延伸子鏈起始部位提供3'端不需要3.大引物PCR定點(diǎn)突變常用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的功能變化。單核苷酸的定點(diǎn)誘變僅需進(jìn)行兩輪PCR即可獲得，第一輪加誘變引物和側(cè)翼引物，第一輪產(chǎn)物作第二輪PCR擴(kuò)增的大引物，如圖表示利用大引物PCR對基因M進(jìn)行定點(diǎn)誘變。下列說法錯(cuò)誤的是（

）A．第一輪PCR中，至少需要2個(gè)循環(huán)才能獲得相應(yīng)的大引物模板B．第二輪PCR所用的引物是第一輪PCR的產(chǎn)物DNA的兩條鏈C．?dāng)U增的定點(diǎn)誘變產(chǎn)物通常需具備啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄D．為了使兩輪PCR在同一支試管中進(jìn)行，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮不同的退火（復(fù)性）溫度對點(diǎn)訓(xùn)練B

2024南昌一模試題(節(jié)選)21.(12分)HNF1α基因突變可引發(fā)糖尿病等疾病。HNF1a的第249位絲氨酸(S249)是其重要功能位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究S249的重要性，研究人員將249位絲氨酸(S)突變?yōu)楸彼?A)，成功構(gòu)建了人源HNF1α-S249A轉(zhuǎn)基因小鼠。下圖為基因表達(dá)載體部分結(jié)構(gòu)示意圖，Myc為標(biāo)記基因，引物F和R之間的序列長度386bp堿基對?；卮鹣铝袉栴}:(3)獲得HNF1α-cDNA后，可利用cDNA中間序列設(shè)計(jì)引物實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變目的，從而制備HNF1α-S249A

cDNA。已知HNF1α中248、249、250三個(gè)氨基酸對應(yīng)的密碼子序列為ACCUCUGUG，丙氨酸對應(yīng)的密碼子有GCU、GCC、GCG、GCA四種，為了保證引物與模板的結(jié)合效率及突變目的，請?jiān)O(shè)計(jì)其中一個(gè)引物:

。ACCGCTGTG或TGGCGACAC對點(diǎn)訓(xùn)練巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（如圖所示），使用兩對（而非一對）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因?yàn)樗鼈冊诘谝淮蜳CR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片段，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低，巢式PCR的擴(kuò)增特異更強(qiáng)。PCR技術(shù)的應(yīng)用7.巢式PCR為減少引物與模板之間的非特異性配對，人們對普通PCR技術(shù)進(jìn)行改良，發(fā)明了巢式PCR，原理是利用兩套引物進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增。首先利用第一對引物（外引物）對目的基因所在的DNA進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，第二輪擴(kuò)增以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用第二對引物（內(nèi)引物或巢式引物）結(jié)合在第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，經(jīng)過15～30次循環(huán)，獲得第二輪擴(kuò)增片段（即目的基因），最終第二輪擴(kuò)增片段短于第一輪，基本過程如圖所示。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．兩對引物的堿基序列不相同，但均應(yīng)為單鏈DNA片段B．使用外引物至少經(jīng)過3次循環(huán)，才能得到圖示的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物C．若第一輪擴(kuò)增產(chǎn)生錯(cuò)誤片段，則其進(jìn)入第二輪擴(kuò)增的概率極低D．普通PCR與巢式PCR相比，特異性更強(qiáng)，錯(cuò)誤率更高D對點(diǎn)訓(xùn)練反向PCR是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴(kuò)增的是已知序列的兩引物之間DNA片段。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇已知序列內(nèi)部沒有切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進(jìn)行酶切，然后用連接酶使帶有黏性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進(jìn)行分析研究。PCR技術(shù)的應(yīng)用8.反向PCR利用反向PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列，如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)。請據(jù)圖回答問題：(1)如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是________(從表格引物①②③④中選擇，填編號(hào))。PCR技術(shù)的應(yīng)用8.反向PCR②④（

2020·江蘇卷

）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如下圖所示(以EcoRⅠ酶切為例)。若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是_____引物①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′②5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′③5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′PCR技術(shù)的應(yīng)用8.反向PCR(4)對PCR產(chǎn)物測序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是___。A.5′—AACTATGCG－－－－AGCCCTT—3′B.5′—AATTCCATG－－－－CTGAATT—3′C.5′—GCAATGCGT－－－－TCGGGAA—3′D.5′—TTGATACGC－－－－CGAGTAC—3′BPCR技術(shù)的應(yīng)用8.反向PCR分4組PCR，都含有4種dNTP，每組一種ddNTP，即每組4+1原料得到特定堿基為末端的片段電泳分析，或電泳后檢測熒光圖譜【進(jìn)一步拓展】1.化學(xué)法DNA測序DNA末端標(biāo)記，再對某種堿基進(jìn)行化學(xué)處理（如甲基化、N化、環(huán)化、去除）等，使DNA序列在特定部位斷裂（類似于ddNTP處理)2.自動(dòng)化測序原理同PCR鏈終止法，只是用不同顏色熒光標(biāo)記不同ddNTP，在一個(gè)泳道中直接得到四色圖譜曲線3.芯片測序PCR技術(shù)的應(yīng)用9.DNA測序(不定項(xiàng))(2024·湖南，15)最早的雙脫氧測序法是在PCR反應(yīng)體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP