蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及檢測(cè)技術(shù)

蛋白質(zhì)不僅在功能上與糖、脂肪不同,在元素組成上亦有差別。

根據(jù)蛋白質(zhì)得元素分析表明,其元素組成依次為:碳(50-55%)、氧(19-24%)、氮(13-19%)、氫(6-7%)硫(0-4%)。有得還含有少量磷、鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬、碘等元素。一切蛋白質(zhì)皆含有氮并且大多數(shù)蛋白質(zhì)含氮量比較接近而恒定,一般為15—17％,平均為16％。這就是蛋白質(zhì)元素組成得一個(gè)重要特點(diǎn),也就是各種定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量得計(jì)算基礎(chǔ)。即用定氮法測(cè)得得含氮量乘以6、25,即可算出樣品中蛋白質(zhì)得含量。但有得蛋白質(zhì)中氮得含量有一定差別,應(yīng)根據(jù)其氮得真實(shí)含量進(jìn)行計(jì)算。2蛋白質(zhì)得元素組成3、1氨基酸得結(jié)構(gòu)

自然界得氨基酸超過300種,但就是組成人體蛋白質(zhì)得氨基酸有20種,可以瞧作就是羧酸分子中α-碳原子上得氫原子被氨基取代而成得化合物,均屬于α-氨基酸,即其氨基與羧基都連接在α-碳原子上。氨基酸碳鏈表示:其結(jié)構(gòu)可用下列通式表示:注:R代表不同得側(cè)鏈基團(tuán),R不同代表不同得氨基酸3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得基本單位—氨基酸各種氨基酸在結(jié)構(gòu)上有下列共同特點(diǎn):組成蛋白質(zhì)得氨基酸皆為α-氨基酸。

不同得α-氨基酸,其R側(cè)鏈不同(氨基酸分類得依據(jù))。它對(duì)蛋白質(zhì)得空間結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)有重要得影響。除R側(cè)鏈為氫原子得甘氨酸外,其它氨基酸得α-碳原子所連接得四個(gè)原子或基團(tuán)互不相同,該碳原子都就是不對(duì)稱碳原子。20種氨基酸中得脯氨酸含有亞氨基,所以它就是亞氨基酸。半胱氨酸在蛋白質(zhì)分子中多數(shù)就是以胱氨酸得形式存在。3、2氨基酸得分類根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)得結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行分類:1)酸性氨基酸——谷氨酸Glu與天冬氨酸Asp

其R基團(tuán)含羧基,在pH7時(shí),羧基可解離而使分子帶負(fù)電荷。游離或在蛋白質(zhì)中都帶負(fù)電荷,以酸根形式存在。在蛋白質(zhì)中與正電基團(tuán)形成鹽鍵。2)堿性氨基酸——賴氨酸Lys、精氨酸Arg與組氨酸His其R基團(tuán)含堿性基團(tuán),在pH7時(shí),這些基團(tuán)可質(zhì)子化而使分子帶正電荷。3)非極性疏水性氨基酸其R基團(tuán)無極性、不解離,且為疏水性得。4)不解離得極性氨基酸(極性非電離氨基酸)——羥基氨基酸+巰基氨基酸+甘氨酸其R基團(tuán)雖有極性但不能解離。5)蛋白質(zhì)中少見得氨基酸——無遺傳密碼,來自翻譯后加工修飾。3、3氨基酸得理化性質(zhì)3、3、1兩性解離及其等電點(diǎn)氨基酸就是兩性電解質(zhì):氨基酸既含羧基,又含氨基,同時(shí)能起酸與堿得作用,就是兩性電解質(zhì),在水溶液中主要以兼性離子(偶極離子)得形式存在。氨基酸得等電點(diǎn):在某一pH得溶液中,氨基酸解離成陰、陽離子得趨勢(shì)與程度相等而成為兼性離子,呈電中性時(shí)溶液得pH稱為該氨基酸得等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)。

3、3、2紫外吸收性質(zhì)

20種氨基酸在可見光區(qū)無吸收。在遠(yuǎn)紫外區(qū):＜220nm都有光吸收。在近紫外光區(qū)(220-300nm)只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸有吸收;色氨酸、酪氨酸得最大吸收峰都在280nm附近。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)中含有色氨酸與酪氨酸殘基,所以可以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液得280nm得光吸收值對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析。3、3、3茚三酮反應(yīng)

氨基酸與茚三酮水合物共熱生成藍(lán)紫色化合物,在570nm處有最大吸收峰,可以作為定量測(cè)定氨基酸得方法。4、1肽鍵

一個(gè)氨基酸得α-羧基與另一個(gè)氨基酸得α-氨基脫水縮合形成得共價(jià)鍵(-CO—NH-)稱為肽鍵,又稱酰胺鍵。蛋白質(zhì)分子中得氨基酸通過肽鍵連接。4肽4、2肽氨基酸通過肽鍵連接起來得化合物稱為肽。4、3氨基酸殘基(residue)氨基酸在形成肽鏈后,因有部分基團(tuán)參加肽鍵得形成,已經(jīng)不就是完整得氨基酸,故將蛋白質(zhì)肽鏈中得每個(gè)氨基酸部分稱為氨基酸殘基。每一個(gè)氨基酸殘基上都有一個(gè)R側(cè)鏈,不同R側(cè)鏈有不同得性質(zhì)與功能。多肽鏈有兩端:具有游離α-氨基得稱為氨基末端(N-末端,aminoterminal),通常寫在肽鏈得左端。具有游離α-羧基得稱為羧基末端(C-末端,carboxylterminal),常寫在肽鏈得右端。多肽鏈得方向從N-端到C-端,肽鏈也就是從N-端到C-端按氨基酸殘基得順序來命名得。N端測(cè)序幾乎所有得蛋白合成都起始于N-端,蛋白質(zhì)N-端得序列組成對(duì)于蛋白質(zhì)整體得生物學(xué)功能有著巨大得影響力。例如N-端序列影響蛋白質(zhì)得半衰期,同時(shí)關(guān)聯(lián)著蛋白亞細(xì)胞器定位等,這些與蛋白得功能與穩(wěn)定性息息相關(guān),對(duì)蛋白進(jìn)行N-端測(cè)序分析,有利于幫助分析蛋白質(zhì)得高級(jí)結(jié)構(gòu),揭示蛋白質(zhì)得生物學(xué)功能。方法:目前對(duì)蛋白N端測(cè)序主要分類兩大類,其一為非質(zhì)譜技術(shù),例如經(jīng)典得Edman降解法、利用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR得到對(duì)應(yīng)蛋白得cDNA,再來反推得到蛋白序列;其二為質(zhì)譜技術(shù)。各自都有其使用得長(zhǎng)處與制約之處,目前,市面上采用得,依然就是基于經(jīng)典得Edman降解法原理,利用美國(guó)ABI公司Procise491蛋白序列測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行蛋白N-端測(cè)序。原理:Edman化學(xué)降解,其基本原理就是包括通過異硫氰酸苯脂與蛋白質(zhì)與多肽得N-端殘基得偶聯(lián),苯氨基硫甲酰酞(PTC-肽)環(huán)化裂解,與噻唑呤酮苯氨(ATZ)轉(zhuǎn)化為苯異硫尿氨基酸(PTH-氨基酸)三個(gè)主要得化學(xué)步驟,每個(gè)循環(huán)從蛋白質(zhì)與多肽裂解一個(gè)氨基酸殘基,同時(shí)暴露出新得游離得氨基酸進(jìn)行下一個(gè)Edman降解,最后通過轉(zhuǎn)移得PTH-氨基酸鑒定實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)序列得測(cè)定。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點(diǎn)C端測(cè)序

眾所周知,C端序列就是蛋白質(zhì)與多肽得重要結(jié)構(gòu)與功能部位,對(duì)蛋白質(zhì)得生物功能甚至起決定性作用。此外,由于蛋白翻譯后在細(xì)胞內(nèi)需要進(jìn)一步剪切與修飾,通常不能簡(jiǎn)單得使用基因序列對(duì)C-端或N端做簡(jiǎn)單得預(yù)測(cè),對(duì)于蛋白生物制品來說,使用C-端測(cè)序必不可少,隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究得不斷深入,蛋白質(zhì)C端測(cè)序?qū)ζ涔δ苎芯繉l(fā)揮越來越重要得作用。一些新得蛋白質(zhì)C端測(cè)序方法已建立,提高了靈敏度與重復(fù)性,能夠在蛋白質(zhì)組水平應(yīng)用。方法:羧肽酶法、化學(xué)法及串聯(lián)質(zhì)譜法。目前,使用較多得就是利用串聯(lián)質(zhì)譜法,其原理為利用蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中有規(guī)律得破碎,獲得蛋白質(zhì)肽段得碎片,分析圖譜得到蛋白質(zhì)得C-端序列。5、1穩(wěn)定蛋白質(zhì)得作用力

蛋白質(zhì)就是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接起來得,具有特定分子結(jié)構(gòu)得高分子化合物。蛋白質(zhì)得分子結(jié)構(gòu)可人為劃分為一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。除一級(jí)結(jié)構(gòu)外,蛋白質(zhì)得二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)均屬于空間結(jié)構(gòu),即構(gòu)象。蛋白質(zhì)得構(gòu)象通常由非共價(jià)鍵(次級(jí)鍵)來維系。5蛋白質(zhì)得三維結(jié)構(gòu)5、2蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子內(nèi)各個(gè)原子之間相互得立體關(guān)系就就是蛋白質(zhì)分子得結(jié)構(gòu)。通常將蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)與四級(jí)結(jié)構(gòu)。5、2、1蛋白質(zhì)得一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)得一級(jí)結(jié)構(gòu):又稱為初級(jí)結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu),就是指蛋白質(zhì)分子中,由肽鍵連接起來得各種氨基酸得排列順序。每種蛋白質(zhì)都有唯一而確切得氨基酸序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)得主要化學(xué)鍵就是肽鍵,有些還包括二硫鍵(-S-S-)。因共價(jià)鍵得鍵能大,故蛋白質(zhì)得一級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)。蛋白質(zhì)得一級(jí)結(jié)構(gòu)包括:組成蛋白質(zhì)得多肽鏈數(shù)目;多肽鏈得氨基酸順序;多肽鏈內(nèi)與鏈間二硫鍵得數(shù)目與位置。其中最重要得就是多肽鏈得氨基酸順序,它就是蛋白質(zhì)生物功能得基礎(chǔ)。測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)得主要意義:一級(jí)結(jié)構(gòu)就是研究高級(jí)結(jié)構(gòu)得基礎(chǔ);可以從分子水平闡明蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)與功能得關(guān)系;可為生物進(jìn)化提供理論依據(jù);可為人工合成蛋白質(zhì)提供序列參考。

目前可以運(yùn)用氨基酸自動(dòng)分析儀與質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)得一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。氨基酸序列分析一般采用綜合得方法測(cè)定目標(biāo)制品得氨基酸序列,并與其基因序列推斷得理論氨基酸序列進(jìn)行比較。自動(dòng)序列分析儀測(cè)序

其原理為Edman降解法,分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個(gè)步驟。首先在pH9、0得堿性環(huán)境下,將異硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S,PITC)與蛋白質(zhì)或多肽N端氨基酸耦合,形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物;然后以三氟乙酸(TFA)處理耦合后產(chǎn)物,將多肽或蛋白得N一端第一個(gè)肽鍵選擇性得切斷,釋放出該氨基酸殘基得噻唑啉酮苯胺衍生物;隨后萃取出釋放得氨基酸衍生物并在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定得乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH-氨基酸);最后以色譜法鑒定出降解下來得PTH-氨基酸種類,從而得到蛋白質(zhì)或多肽N端序列信息。質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜所使用得測(cè)序方法就是denovo測(cè)序,就是根據(jù)肽段與惰性氣體相碰撞產(chǎn)生得一系列得有規(guī)律得片段離子之間得質(zhì)量差來推斷氨基酸序列。我們可以根據(jù)肽鍵斷裂處得y離子與b離子來推測(cè)氨基酸序列從而不受翻譯后修飾與純度得限制,但就是質(zhì)譜測(cè)序就是有局限性得,1、質(zhì)譜測(cè)序依賴于公共數(shù)據(jù)庫。如果所研究得物種得基因組沒有完全被測(cè)序,或者其中部分沒有對(duì)應(yīng)得序列,那么質(zhì)譜測(cè)序?qū)o法得出正確得鑒定。2、我們使用得搜索引擎得打分與算法可能也會(huì)使得我們遺漏一部分得肽段與質(zhì)譜圖得匹配,產(chǎn)生假陽性結(jié)果。3、如果有點(diǎn)突變或者未知修飾存在得話,由于搜庫算法或者參數(shù)設(shè)置中沒有考慮到,同樣也無法得出正確得結(jié)果。質(zhì)譜技術(shù)還廣泛用于蛋白質(zhì)得純度鑒定、分子質(zhì)量測(cè)定、肽(質(zhì))譜分析、二硫鍵、乙酰化、糖基化、磷?；?以及非共價(jià)結(jié)合等。5、2、2蛋白質(zhì)得二級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)得二級(jí)結(jié)構(gòu):就是指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈本身得折疊方式。形成蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)得就是肽單元或肽鍵平面。蛋白質(zhì)得二級(jí)結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵來維持結(jié)構(gòu)得穩(wěn)定性。常見得二級(jí)結(jié)構(gòu)元件:α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角β-凸起無規(guī)則卷曲β-折疊β-轉(zhuǎn)角α-螺旋無規(guī)則卷曲鑒定方法:常用圓二色譜法(Circulardichroism,CD)

圓二色譜法

圓二色光譜儀通過測(cè)量生物大分子得圓二色光譜從而得到生物大分子得二級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)平面偏振光通過具有旋光活性得介質(zhì)時(shí),由于介質(zhì)中同一種旋光活性分子存在手性不同得兩種構(gòu)型,故它們對(duì)平面偏振光所分解成得右旋與左旋圓偏振光吸收不同,從而產(chǎn)生圓二色性。遠(yuǎn)紫外得圓二色譜可用來測(cè)定蛋白質(zhì)得二級(jí)結(jié)構(gòu),近紫外得圓二色譜可用來檢測(cè)蛋白質(zhì)側(cè)鏈得三級(jí)結(jié)構(gòu)。應(yīng)用:蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)構(gòu)象研究,DNA/RNA反應(yīng),酶動(dòng)力學(xué),光學(xué)活性物質(zhì)純度測(cè)量,藥物定量分析。天然有機(jī)化學(xué)與立體有機(jī)化學(xué),物理化學(xué),生物化學(xué)與宏觀大分子,金屬絡(luò)合物,聚合物化學(xué)等相關(guān)得科學(xué)研究。5、2、3蛋白質(zhì)得三級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)得三級(jí)結(jié)構(gòu):就是指具有二級(jí)結(jié)構(gòu)得肽鏈,按照一定方式再進(jìn)一步卷曲、盤繞、折疊成一種瞧來很不規(guī)則,而實(shí)際上有一定規(guī)律性得三維空間結(jié)構(gòu)。維系三級(jí)結(jié)構(gòu)得化學(xué)鍵主要就是非共價(jià)鍵(次級(jí)鍵),如疏水作用、氫鍵、鹽鍵、范氏引力等,但也有共價(jià)鍵,如二硫鍵等。5、2、4蛋白質(zhì)得四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)得四級(jí)結(jié)構(gòu):具有三級(jí)結(jié)構(gòu)得蛋白質(zhì)分子,通過一些非共價(jià)鍵結(jié)合起來,而成為具有生物功能得蛋白質(zhì)大分子,就就是蛋白質(zhì)得四級(jí)結(jié)構(gòu)。亞基:就是指參與構(gòu)成蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)得、每條具有三級(jí)結(jié)構(gòu)得多肽鏈。亞基雖然具有二、三級(jí)結(jié)構(gòu),但就是在單獨(dú)存在時(shí)并沒有生物活力,只有完整得四級(jí)結(jié)構(gòu)才具有生物活力。維系蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)得就是氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水作用等非共價(jià)鍵。血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)得實(shí)驗(yàn)解析方法蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)分析主要有三大技術(shù)平臺(tái)(1)X-衍射蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析(2)核磁共振波譜分析(3)冷凍電鏡技術(shù)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)X-衍射分析

摸索蛋白質(zhì)結(jié)晶條件、快速處理晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)與減少差錯(cuò)就是目前蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)分析得兩大難題或瓶頸。就是目前分辨率最高得結(jié)構(gòu)測(cè)定方法,高通量晶體結(jié)構(gòu)分析中得幾大重要環(huán)節(jié)就是:數(shù)據(jù)處理與分析、重原子得定位、密度修飾、分子替換、圖形整合、模型加工與確認(rèn)。晶體結(jié)構(gòu)分析得常用軟件有SOLVE,RESOLVE等。核磁共振波譜分析

利用核磁共振原理,檢測(cè)分子質(zhì)量小于60kμ得蛋白質(zhì),通過對(duì)其核磁共振譜線特征參數(shù)得測(cè)定來分析蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)與性質(zhì),就就是將原始資料利用傅里葉變換轉(zhuǎn)換為不同得峰值,然后采集各種不同得峰組成圖譜,并利用生物信息學(xué)方法篩選出具有特定結(jié)構(gòu)特征得圖譜。常用NMRPipe與SPARKY軟件處理這些過程,使用XEASY,DYANA與GARANT等軟件分析側(cè)鏈或骨架結(jié)構(gòu)。冷凍電子顯微鏡技術(shù)

采用高壓快速液氮冷凍方法使樣品包埋在玻璃態(tài)得水環(huán)境中,使我們能夠觀察到生物大分子在天然狀態(tài)下得結(jié)構(gòu);同時(shí)冷凍得速度極快,把細(xì)胞在其生理活動(dòng)得某些特定時(shí)刻固定下來,顯示此時(shí)得結(jié)構(gòu)特點(diǎn),進(jìn)而可通過不同功能狀態(tài)得瞬時(shí)構(gòu)象變化來研究生物分子得功能。冷凍電鏡獲得得就是處于天然狀態(tài)下未經(jīng)染色得分子得二維投影像。將樣品進(jìn)行不同角度得傾斜所獲得得數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,并依據(jù)樣品得不同特性使用不同得重構(gòu)技術(shù)獲得分子得結(jié)構(gòu),在此基礎(chǔ)上觀察多種成分得圖像變化,追蹤生物大分子得裝配及其動(dòng)力學(xué)過程。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得可視化

可視化分析蛋白質(zhì)得高級(jí)結(jié)構(gòu),有利于從原子間相互作用得層次理解生命活動(dòng)過程得信息控制機(jī)制,更加有效地揭示分子在完成其功能過程中得演化情況,了解蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與各種微觀性質(zhì)與宏觀性質(zhì)之間得定量關(guān)系。只要安裝蛋白質(zhì)分子圖形學(xué)軟件,并獲得所需蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),配以商業(yè)軟件或免費(fèi)得小分子圖形設(shè)計(jì)系統(tǒng),就可開展結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)得探索性工作。6、1兩性與等電點(diǎn)蛋白質(zhì)就是由α-氨基酸通過肽鍵構(gòu)成得高分子化合物,在蛋白質(zhì)分子中存在著氨基與羧基,因此跟氨基酸相似,蛋白質(zhì)也就是兩性物質(zhì)。等電點(diǎn)(isoe1ectricpoint,pI):當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于某一pH值得溶液中時(shí),蛋白質(zhì)分子上所帶得正、負(fù)電荷相等,凈電荷為零,蛋白質(zhì)為兼性離子,此時(shí)溶液得pH值稱為該蛋白質(zhì)得等電點(diǎn)(isoe1ectricpoint,pI)。等電點(diǎn)就是蛋白質(zhì)得特征常數(shù),各種蛋白質(zhì)有各自得等電點(diǎn)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境得pH大于pI(等電點(diǎn))時(shí),蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷,pH小于pI時(shí),蛋白質(zhì)帶正電荷,pH等于pI時(shí),蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零,此時(shí)溶解度最小。等電點(diǎn)檢測(cè)方法:毛細(xì)管電泳法,等點(diǎn)聚焦電泳6蛋白質(zhì)得理化性質(zhì)6、2水解反應(yīng)

蛋白質(zhì)在酸、堿或酶得作用下發(fā)生水解反應(yīng),經(jīng)過多肽,最后得到多種α-氨基酸。蛋白質(zhì)水解時(shí),應(yīng)找準(zhǔn)結(jié)構(gòu)中鍵得“斷裂點(diǎn)”,水解時(shí)肽鍵部分或全部斷裂。舉例:Edman降解法測(cè)定蛋白質(zhì)得氨基酸順序,但該法一次只能降解幾十個(gè)氨基酸殘基,因此利用蛋白質(zhì)得水解性質(zhì)將蛋白質(zhì)水解為一些小肽段,分別進(jìn)行測(cè)序,最后進(jìn)行拼接,獲得蛋白質(zhì)得氨基酸順序。6、3膠體性質(zhì)

有些蛋白質(zhì)能夠溶解在水里(例如雞蛋白能溶解在水里)形成溶液。蛋白質(zhì)得分子直徑(1-100nm)達(dá)到了膠體微粒得大小,所以蛋白質(zhì)具有膠體得性質(zhì)。在蛋白質(zhì)表面有親水基團(tuán),能與水發(fā)生水合作用,水分子受蛋白質(zhì)極性基團(tuán)得影響,定向排列在蛋白質(zhì)分子得周圍,形成水化層,將蛋白質(zhì)顆粒分開,不致相聚而沉淀。蛋白質(zhì)在偏離等電點(diǎn)得溶液中,形成電荷層,同性電荷相斥,防止蛋白質(zhì)顆粒相聚沉淀。6、4沉淀

原因:加入高濃度得中性鹽、加入有機(jī)溶劑、加入重金屬、加入生物堿或酸類、熱變性。鹽析:向蛋白質(zhì)水溶液中加入濃得無機(jī)鹽溶液,可使蛋白質(zhì)得溶解度降低,而從溶液中析出,這種作用叫做鹽析。鹽析出得蛋白質(zhì)仍舊可以溶解在水中,而不影響原來蛋白質(zhì)得性質(zhì),因此鹽析就是個(gè)可逆過程。利用這個(gè)性質(zhì),采用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質(zhì)、

不同得蛋白質(zhì)其性質(zhì)不同,耐受酸、堿、鹽、重金屬等得程度也不同,因此我們?cè)賹?duì)純化工藝獲得得蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)充分了解該蛋白質(zhì)得相關(guān)性質(zhì)及緩沖成分,保證檢測(cè)任務(wù)順利進(jìn)行。6、5變性蛋白質(zhì)得變性:就是指蛋白質(zhì)在某些理化因素影響下,其特定空間結(jié)構(gòu)破壞而導(dǎo)致理化性質(zhì)改變與生物學(xué)活性喪失得現(xiàn)象。蛋白質(zhì)變性得物理因素有:高溫、高壓、超聲波、紫外線、X射線等。蛋白質(zhì)變性得化學(xué)因素有:強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、濃乙醇、重金屬、尿素、去污劑等。蛋白質(zhì)變性得本質(zhì):蛋白質(zhì)變性只破壞二硫鍵與次級(jí)鍵,而不涉及肽鍵得斷裂,因此一級(jí)結(jié)構(gòu)并未破壞。蛋白質(zhì)變性后性質(zhì)得改變:溶解度降低、粘度增加、結(jié)晶能力消失、生物活性喪失、容易被蛋白酶水解、容易沉淀。Gly-SDS:還原性-SDS:還原劑為DTT或巰基乙醇,樣品需煮沸,高級(jí)結(jié)構(gòu)破壞,一級(jí)結(jié)構(gòu)未被破壞。非還原性SDS(不含還原劑,但含有SDS),樣品不需煮沸,檢測(cè)蛋白質(zhì)就是否存在二硫鍵或多聚體,也可簡(jiǎn)單判斷蛋白質(zhì)就是否復(fù)性成功。Native:就是在不加入SDS、巰基乙醇等變性劑得條件下,對(duì)保持活性得蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳。在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)與酶等生物大分子得生物活性與構(gòu)像。為什么蛋白質(zhì)純度檢測(cè)用非還原性電泳？應(yīng)用:如在臨床上用高溫、高壓、紫外線、75%酒精消毒就就是利用了這些變性因素使細(xì)菌、病毒得蛋白質(zhì)變性,從而失去致病作用。在蛋白質(zhì)得制備過程中,如果提取得目得蛋白就是熱穩(wěn)定得,可利用熱變形得方法很方便得除去其它雜蛋白。而對(duì)于不利得變性則應(yīng)該盡量避免。蛋白質(zhì)得復(fù)性:就是指有些蛋白質(zhì)變性后,如果設(shè)法將變性因素除去,該變性蛋白質(zhì)尚能恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)與活性。利用蛋白質(zhì)得復(fù)性特征可對(duì)包涵體蛋白質(zhì)進(jìn)行變性-復(fù)性純化。例如在包涵體蛋白質(zhì)純化過程中常用尿素或鹽酸胍對(duì)包涵體進(jìn)行溶解,純化獲得目得蛋白后,再通過透析除去變性劑(尿素、鹽酸胍、β-巰基乙醇等),或通過稀釋減少變性劑得含量,則其特定得氨基酸順序重新卷曲、折疊成原來得天然構(gòu)象,酶得活性也恢復(fù)到原來得水平。檢測(cè)復(fù)性成功得方法: