廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）編制說明一、項(xiàng)目來源根據(jù)《關(guān)于下達(dá)2016年第六批廣西地方標(biāo)準(zhǔn)制定（修訂）項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂質(zhì)監(jiān)函〔2016〕324號）文件精神，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)提出，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)起草廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（項(xiàng)目編號為2016-06066）。二、項(xiàng)目背景及目的意義老鼠簕（AcanthusilicifoliusL）是爵床科老鼠簕屬的植物，分布在我國廣西、福建、海南、廣東等地的潮汐能地帶、海岸或海濱地帶，具有多種實(shí)用價(jià)值，除了是傳統(tǒng)海洋中藥外，還可用于環(huán)保、食品、飼料等行業(yè)，市場遠(yuǎn)景廣闊。因此，為了更好地保護(hù)和應(yīng)用這一植物資源，提高其質(zhì)量和創(chuàng)匯能力，促進(jìn)其推廣應(yīng)用，我們提出了制定《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》的建議。三、項(xiàng)目編制過程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組本項(xiàng)目實(shí)行在項(xiàng)目主持人負(fù)責(zé)下的小組負(fù)責(zé)制，各個(gè)實(shí)施單位指定研究小組組長和成員后，對項(xiàng)目任務(wù)進(jìn)行分解和分配，明確各小組的責(zé)任、項(xiàng)目實(shí)施計(jì)劃，對小組成員的職責(zé)和進(jìn)度進(jìn)行細(xì)化，確保項(xiàng)目高效如期進(jìn)行。在標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目下達(dá)后及時(shí)成立了以廣西中醫(yī)藥大學(xué)侯小濤教授主持，鄧家剛、郝二偉、杜正彩、秦健峰為參與成員的標(biāo)準(zhǔn)編制小組，及時(shí)部署了標(biāo)準(zhǔn)編制的工作方案和時(shí)間進(jìn)度表。在標(biāo)準(zhǔn)起草前，研究了老鼠簕的相關(guān)文獻(xiàn)資料，并對課題研究成果進(jìn)行了全面整理和總結(jié)討論。在編制過程中，還深入廣西各大主要產(chǎn)區(qū)廣泛資源調(diào)查，同時(shí)咨詢了相關(guān)權(quán)威專家，力爭編制工作過程科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)，方法、技術(shù)路線正確。（二）收集整理文獻(xiàn)資料以及前期工作基礎(chǔ)迄今為止，標(biāo)準(zhǔn)起草小組成員對老鼠簕相關(guān)研究進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)收集以及進(jìn)行了一系列藥效篩選及化學(xué)成分的初步研究。迄今為止，標(biāo)準(zhǔn)起草小組成員對老鼠簕相關(guān)研究進(jìn)行了大量的文獻(xiàn)收集以及進(jìn)行了一系列藥效篩選及化學(xué)成分的初步研究。國內(nèi)外的研究表明，老鼠簕植物中含有多糖、生物堿、黃酮、萜類和甾體、飽和直鏈和支鏈烴、脂肪酸酯類等化合物。老鼠簕具有抗氧化和肝保護(hù)作用、抗腫瘤活性、抗炎活性等多方面的藥理活性。結(jié)合化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)，對老鼠簕進(jìn)行了含量測定的研究。（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在對收集的資料以及前期研究基礎(chǔ)進(jìn)行整理研究之后，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組召開了標(biāo)準(zhǔn)編制會議，對標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，并對標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)過研究，標(biāo)準(zhǔn)該部分的主體內(nèi)容確定為范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝、運(yùn)輸和貯存。（四）調(diào)研及形成征求意見稿在前期工作的基礎(chǔ)之上，通過理清邏輯脈絡(luò)，整合已有的參考資料中有關(guān)老鼠簕質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，并結(jié)合廣西老鼠簕質(zhì)量控制實(shí)際要求的基礎(chǔ)上，按照簡化、統(tǒng)一等原則編制完成廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（草案）。2016年7月，廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》獲自治區(qū)質(zhì)監(jiān)局批準(zhǔn)立項(xiàng)。2016年8月-12月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組組織部門有關(guān)專家征求廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（草案）意見。2017年1月-2018年12月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組按照專家意見進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的完善。2019年1月-12月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組在南寧市組織全區(qū)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍V西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》進(jìn)行征求意見。經(jīng)過多次討論、研究，最終形成廣西地方標(biāo)準(zhǔn)《老鼠簕質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)程》（征求意見稿）和編制說明。四、標(biāo)準(zhǔn)主要章節(jié)內(nèi)容及確定依據(jù)（一）標(biāo)準(zhǔn)涉及的技術(shù)原理及依據(jù)采用現(xiàn)代分析技術(shù)對老鼠勒的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)進(jìn)行分析測定，對老鼠簕進(jìn)行質(zhì)量控制是本標(biāo)準(zhǔn)制定的出發(fā)點(diǎn)。水分的測定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0832中第二法的規(guī)定測定?？偦曳值臏y定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2303的規(guī)定測定。浸出物的測定：按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則2201的規(guī)定測定，用20%乙醇溶液作溶劑。2-苯并噁唑啉酮的含量測定：采用高效液相色譜法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0512）測定。（二）、標(biāo)準(zhǔn)涉及技術(shù)的具體實(shí)施方案按照廣西壯族自治區(qū)市場監(jiān)督管理局關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)編制工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草小組成員于項(xiàng)目實(shí)施期間，深入廣西欽州、北海、防城港等地區(qū)開展資源調(diào)查、樣品采集。1、水分含量測定取供試品2g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，開啟瓶蓋在105°C干燥5小時(shí)，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時(shí)，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量（％)。結(jié)果：根含水量7.57%；莖含水量8.39%；葉含水量8.64%。2、浸出物的含量測定供試品粉碎，過60目篩，并混合均勻。取供試品約4g，精密稱定，置250ml的錐形瓶中，精密加乙醇100ml，密塞，冷浸，前6小時(shí)內(nèi)時(shí)時(shí)振搖，再靜置18小時(shí)，用干燥濾器迅速濾過，精密量取續(xù)濾液20ml,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小時(shí)，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量。結(jié)果：根浸出物含量為2.05%；莖浸出物含量為2.35%；葉浸出物含量為3.21%。3、總灰分的測定取固體試樣3~5g（粉碎過2號篩），加入恒重的坩堝內(nèi)，準(zhǔn)確稱量（精確至0.0001g），先以小火加熱使樣品先炭化至無煙，然后至高溫爐中，在500℃～600℃熾灼約4h，冷卻至200℃以下后取出放入干燥器中冷卻0.5h。若炭化不完全，加熱水或者10%硝酸銨溶液2mL，使殘?jiān)鼭駶?、蒸干，繼續(xù)按上述步驟熾灼，至內(nèi)容物完全炭化?？偦曳?（殘?jiān)佰釄逯亓?空坩堝重量）/樣品重量×100%。結(jié)果：根總灰分為13.35%；莖總灰分為12.93%；葉總灰分為13.21%。4、2-苯并噁唑啉酮含量測定4.1色譜條件：SHIMADZU（Pak-C18）色譜柱（5mm，4.6mm×250mm），流動相：(A)乙腈-(B)水（30∶70）；流速1.0mL/min；檢測波長：270nm，柱溫：25℃；進(jìn)樣量10mL。4.2對照品溶液的制備精密稱取干燥的2-苯并噁唑啉酮對照品2.4mg，用色譜甲醇定容至25mL容量瓶中，溶解、搖勻，備用。4.3老鼠簕提取單因素考察提取溶劑的選擇精密稱定三份老鼠簕藥材粉末2g，置于100ml燒瓶中，分別加15倍量的蒸餾水、甲醇、乙醇，59℃條件下水浴回流2.5h，提取2次，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，抽濾轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。過0.45mm微孔濾膜，按4.1項(xiàng)下擬定條件進(jìn)行分析測定，記錄數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果：當(dāng)提取溶劑為甲醇時(shí)，提取效果最佳。表1提取溶劑提取率（%）甲醇0.0227乙醇0.0218水0.0208提取方法的選擇精密稱定4份老鼠簕藥材粉末2g，1份置于100ml燒瓶中，加15倍量的甲醇，59℃水浴回流2.5h，提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，抽濾轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用；另3份置于100ml錐形瓶中，加15倍量甲醇，分別于59℃條件下超聲提取20，30，45min（功率500W40kHz），提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，抽濾轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。測定含量，記錄數(shù)據(jù)見表2。結(jié)果：采用回流法時(shí)，提取效果最佳。表2提取方法提取率（%）回流法0.0227超聲20min0.0175超聲30min0.0184超聲45min0.0174醇濃度的選擇精密稱定10份老鼠簕藥材粉末2g，置于100ml燒瓶中，分別加15倍量濃度為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇，59℃水浴回流2.5h，提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙猓闉V轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。測定含量，記錄數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果：采用20%甲醇時(shí)，提取效果最佳。表3醇濃度提取率（%）10%0.025120%0.028530%0.027840%0.025250%0.023260%0.027770%0.024280%0.022590%0.0196100%0.0229提取時(shí)間的選擇精密稱定5份老鼠簕藥材粉末2g，置于100ml燒瓶中，加15倍量20%甲醇，分別于59℃水浴回流0.5h，1.0h，1.5h，2h，2.5h，提取2次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，抽濾轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。測定含量，記錄數(shù)據(jù)見表4。結(jié)果：提取時(shí)間為1.5h時(shí)，效果最佳。表4提取時(shí)間（h）提取率（%）0.50.02151.00.02511.50.03352.00.03022.50.0302提取次數(shù)的選擇精密稱定5份老鼠簕藥材粉末2g，置于100ml燒瓶中，加15倍量20%甲醇，于59℃水浴回流1.5h，提取次數(shù)分別為1，2，3，4，5次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙猓闉V轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。測定含量，記錄數(shù)據(jù)見表5。結(jié)果：提取4次效果最佳。表5提取次數(shù)提取率（%）10.025920.030330.032940.039250.0392料液比的選擇精密稱定5份老鼠簕藥材粉末2g，置于100ml燒瓶中，分別加9，11，13，15，17倍量20%甲醇，59℃水浴回流1.5h，提取4次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，抽濾轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。測定含量，記錄數(shù)據(jù)見表6。結(jié)果：選擇13倍量提取溶劑效果最佳。表6料液比提取率（%）1:90.03711:110.03911:130.04081:150.04071:170.0407提取溫度的選擇精密稱定5份老鼠簕藥材粉末2g，置于100ml燒瓶中，加13倍量20%甲醇，分別于49，59，69，79，89℃水浴回流1.5h，提取4次，合并濾液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙猓闉V轉(zhuǎn)入10ml容量瓶內(nèi)，加甲醇定容至刻度搖勻備用。測定含量，記錄數(shù)據(jù)見表7。結(jié)果：選擇89℃提取效果最佳。表7提取溫度（℃）提取率（%）490.0362590.0406690.0511790.0568890.06364.4響應(yīng)面法對老鼠簕中2-苯并噁唑啉酮提取條件的優(yōu)化 據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，對含量結(jié)果有顯著影響的分別為提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)及醇濃度(D)。根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)原理，采用四因素三水平的分析方法實(shí)驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝，以2-苯并噁唑啉酮的百分含量（%）為考察指標(biāo)，在高效液相色譜條件乙腈：水30:70，檢測波長270nm下進(jìn)行分析。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析變異來源平方和自由度均方F值P值模型7.669E-004145.478E-0059.84<0.0001significantA-A4.206E-00714.206E-0070.0760.7874B-B1.244E-00411.244E-00422.350.0003C-C1.088E-00411.088E-00419.550.0006D-D9.146E-00519.146E-00516.440.0012AB1.426E-00511.426E-0052.560.1318AC5.781E-00615.781E-0061.040.3253AD1.575E-00511.575E-0052.830.1146BC1.271E-00611.271E-0060.230.6401BD5.987E-00615.987E-0061.080.3172CD4.806E-00514.806E-0058.640.0108A21.534E-00411.534E-00427.570.0001B22.229E-00412.229E-00440.06<0.0001C29.214E-00519.214E-00516.560.0011D24.760E-00514.760E-0058.550.0111殘差7.790E-005145.564E-006失擬項(xiàng)3.921E-005103.921E-0060.410.8875notsignificant凈誤差3.869E-00549.674E-006總變異8.448E-00428由方差分析已知，模型的F值為9.84?！癙rob>F”的值小于0.0500,說明二次方程擬合顯著。失擬項(xiàng)為0.8875，說明失擬項(xiàng)絕對誤差不顯著。在此情況下，B，C，D，CD，A2，B2，C2，D2均有顯著影響，其中CD具有交互作用。4.5薄層鑒別4.5.1芹菜素薄層對照品溶液的制備精密稱定芹菜素對照品加甲醇溶解制得濃度為0.02mg/ml的芹菜素對照品溶液。供試品溶液的制備精密稱定老鼠簕藥材全株粉末1g，加乙酸乙酯20ml超聲提取20mi