第11章植物組織培養(yǎng)

提要植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)材料的清洗與消毒培養(yǎng)基接種種質(zhì)保存植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物的無性繁殖：不經(jīng)過雌雄配子的結(jié)合，通過母體的部分組織或器官來進(jìn)行繁殖的方式。特點(diǎn)：不發(fā)生遺傳重組，后代與親代在遺傳上完全一致優(yōu)點(diǎn)：短期內(nèi)獲得大量的后代

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物細(xì)胞全能性(totopotent)理論：植物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有整株植物的全部遺傳信息，都有分化成一個(gè)完整植株的潛在能力。

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細(xì)胞分化(differentiation)：細(xì)胞后代在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程。細(xì)胞在分化過程中，經(jīng)歷全能性-多能性-單能性-成熟定型細(xì)胞分化的細(xì)胞一般不在分裂分化表現(xiàn)在細(xì)胞多個(gè)方面的差異

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細(xì)胞的脫分化(dedifferentiation)：分化的細(xì)胞在一定條件下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约?xì)胞，重新獲得分裂能力。愈傷組織：脫分化的細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性、松散的細(xì)胞團(tuán)靜止細(xì)胞被活化：代謝活動(dòng)迅速增加、細(xì)胞質(zhì)增加、胞質(zhì)流動(dòng)活躍、核糖體大量累積、蛋白質(zhì)合成旺盛、RNA含量迅速增加。植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細(xì)胞的再分化和器官發(fā)生細(xì)胞的再分化(redifferentiation)：脫分化后的分生細(xì)胞在一定條件下，重新分化為各種類型的細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成完整植株愈傷組織再分化形成再生植株的途徑：器官發(fā)生途徑：愈傷組織誘導(dǎo)形成器官，再形成完整植株（先根后芽或先芽后根）胚狀體發(fā)生途徑：由愈傷組織誘導(dǎo)形成類似種子的胚的結(jié)構(gòu)，同時(shí)產(chǎn)生芽端和根端的結(jié)構(gòu)，稱胚狀體。經(jīng)過與合子胚相似的發(fā)育過程，形成完整植株。

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)胚狀體類型體細(xì)胞胚、生殖細(xì)胞胚

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)分化期細(xì)胞在生理、生化方面有劇烈的變化酶的活性增強(qiáng)、營養(yǎng)物質(zhì)累積、RNA和組蛋白的合成速度加快分化期細(xì)胞的形態(tài)大小保持相對(duì)穩(wěn)定，愈傷組織不再增殖，細(xì)胞由平周分裂轉(zhuǎn)變?yōu)榻M織內(nèi)部局部的分裂，形成“瘤狀”或“片狀”的分生組織結(jié)構(gòu)。

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的因素內(nèi)部因子：遺傳性狀、生理狀況外部因子：營養(yǎng)條件、環(huán)境條件植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物激素在植物細(xì)胞分化和再分化中的作用激素在細(xì)胞分化中起著重要的有時(shí)是決定性的作用生長素是植物脫分化培養(yǎng)基中不可缺少的成分生長素作用機(jī)制：可以與組蛋白結(jié)合，活化相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)細(xì)胞分裂2，4-D作用：啟動(dòng)細(xì)胞脫分化，形成胚性細(xì)胞團(tuán)廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)各種愈傷組織的培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素作用：能夠維持并促進(jìn)脫分化細(xì)胞分裂

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)植物激素在植物細(xì)胞分化和再分化中的作用生長素、分裂素是植物細(xì)胞再分化中不可缺少的激素生長素能促進(jìn)植物根的形成并抑制芽的形成生長素/細(xì)胞分裂素的比例，影響愈傷組織的生長和器官的發(fā)生植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)其它影響植物細(xì)胞脫分化和再分化的條件機(jī)械和生理隔離對(duì)植物細(xì)胞的脫分化和再分化非常重要原因：植物離體培養(yǎng)將培養(yǎng)的細(xì)胞、組織、器官從植物體上分離下來，解除制約，從而使之恢復(fù)到分生組織狀態(tài)切割創(chuàng)傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的一些物質(zhì)也可能影響到基因的表達(dá)，改變植物的代謝途徑，朝向胚性細(xì)胞的方向發(fā)展

植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)：在含有營養(yǎng)物質(zhì)及植物生長物質(zhì)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)離體植物組織并誘導(dǎo)使其長成完整植株的技術(shù)。

植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的細(xì)胞、組織或器官發(fā)育成完整植株方式體細(xì)胞胚胎發(fā)生器官形成

實(shí)驗(yàn)材料的清洗和消毒清洗自來水流水沖洗5分鐘，用中性洗衣粉液清洗，自來水流水沖洗30分

實(shí)驗(yàn)材料的清洗和消毒消毒：藥劑滅毒法適用：培養(yǎng)材料的表面消毒藥劑選擇：根據(jù)培養(yǎng)材料的特點(diǎn)，選擇適合的藥劑種類、濃度、消毒時(shí)間消毒原則：即達(dá)到滅菌的目的，又不能損傷植物組織和細(xì)胞各種藥劑的使用濃度和浸泡時(shí)間應(yīng)依據(jù)植物種類和取用的器官部位不同進(jìn)行滅菌實(shí)驗(yàn)材料的清洗和消毒具體情況：具有較厚蠟質(zhì)和角質(zhì)層的材料，在藥劑滅菌時(shí)加入少量表面活性劑器官外植體滅菌，一般采用多種藥劑配合使用的方法如果外植體較硬較大，容易操作，可直接用滅菌劑處理未成熟胚珠、胚或胚乳，分別把子房或胚珠進(jìn)行表面消毒，然后在無菌條件下把外植體解剖出來

實(shí)驗(yàn)材料的清洗和消毒具體情況：柔嫩的莖尖、花粉粒，莖芽、花蕾表面消毒，無菌條件下取出外植體殺菌劑處理之前，先用75%的酒精浸泡30秒，或在消毒溶液里加幾滴表面活化劑，提高殺菌效果表面消毒處理后，必須在無菌蒸餾水中漂洗3-4次，除掉殘留的殺菌劑外植體表面污染嚴(yán)重，須先用流水沖洗1小時(shí)或更長時(shí)間

培養(yǎng)基是植物細(xì)胞、組織、器官離體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質(zhì)，含有植物細(xì)胞生長分化所必須的各種營養(yǎng)成分和生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。對(duì)培養(yǎng)基成分的篩選和優(yōu)化是植物組織培養(yǎng)中非常重要步驟

培養(yǎng)基早期的植物組織培養(yǎng)基是White提出的培養(yǎng)基和Gautheret提出的愈傷組織培養(yǎng)基，由用于整體植物栽培的營養(yǎng)液發(fā)展來以后所有的各種培養(yǎng)基都是建立在White培養(yǎng)基和Gautheret培養(yǎng)基基礎(chǔ)上的。

培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成無機(jī)營養(yǎng)成分大量元素：氮、磷、硫、鈣、鉀、鎂>0.5mmol/L微量元素：鐵、錳、銅、鋅、硼、鉬<0.5mmol/L常用培養(yǎng)基組分上的主要差別：各種鹽或離子數(shù)量上的不同各種植物組織所需要的無機(jī)鹽營養(yǎng)在質(zhì)上是相當(dāng)一致的。培養(yǎng)基中的活性因子就是這些離子

培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成無機(jī)營養(yǎng)成分鐵：Fe·EDTA無機(jī)氮：硝酸鹽、銨鹽

培養(yǎng)基-有機(jī)營養(yǎng)成分植物離體細(xì)胞分裂和分化所必需的有機(jī)碳、氫、氮、能量是以糖類、氨基酸、維生素的形式提供的。碳源：最常用的碳源是蔗糖，濃度2%-5%含氮物質(zhì)：維生素（硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣、肌醇）；化學(xué)成分不明的復(fù)雜營養(yǎng)混合物（椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、番茄汁、酵母浸出物）

培養(yǎng)基-植物激素類生長素自然界中，影響莖和節(jié)間的生長、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落、生根；組織培養(yǎng)中用于誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化常用的生長素：IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)等

培養(yǎng)基-植物激素類細(xì)胞分裂素類自然界中，影響細(xì)胞分裂、頂端優(yōu)勢(shì)的分化和莖的分化組織培養(yǎng)中，促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織或器官上分化不定芽常用細(xì)胞分裂素：BAP(卞氧基嘌呤)、激動(dòng)素等赤霉素刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚正常發(fā)育成小植株常用的是GA3

培養(yǎng)基-瓊脂瓊脂是一種由海藻得來多糖類物質(zhì)。瓊脂的一般使用濃度是0.7%-1%瓊脂并非培養(yǎng)基中必需成分

培養(yǎng)基的選擇不同的試驗(yàn)體系需要不同的培養(yǎng)基，一種適合某種培養(yǎng)目的的培養(yǎng)基成分，一般是在已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列的實(shí)驗(yàn)確定的試驗(yàn)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)最佳組合：生長素、細(xì)胞分裂素確定培養(yǎng)基鹽分濃度確定適合的蔗糖濃度

培養(yǎng)基的制備市售培養(yǎng)基干粉按照配方規(guī)定的數(shù)量分別稱量出各種成分，分別溶解于水，然后再混合在一起先配制一系列的濃縮儲(chǔ)備液（母液），包括大量元素、微量元素、鐵鹽、除蔗糖外的有機(jī)物質(zhì)

培養(yǎng)基的制備步驟稱量瓊脂和蔗糖，加熱溶解加入一定量的各種儲(chǔ)備液加蒸餾水至終體積調(diào)節(jié)PH值分裝包裝、滅菌保存

培養(yǎng)基的滅菌高壓蒸汽滅菌：適用于固體培養(yǎng)基過濾除菌：適用于液體培養(yǎng)基

接種經(jīng)過表面滅菌的實(shí)驗(yàn)材料，按照不同的要求，移植培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程。步驟消毒無菌水清洗無菌器具切取外植體接種到培養(yǎng)基

種質(zhì)保存

許多植物的組織培養(yǎng)物在液氮中超低溫保存以后，仍然能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原來的遺傳特性保存方法材料的選擇，預(yù)處理，降溫冰凍，解凍，活力測定，再培養(yǎng)

種質(zhì)保存超低溫保存的意義：能保持細(xì)胞培養(yǎng)物的穩(wěn)定性長期保存植物的種質(zhì)資源長期保存農(nóng)作物的優(yōu)良品種及其育種親本材料的種質(zhì)

植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)業(yè)化前景植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)攪拌式生物反