第11章植物組織培養(yǎng)

提要植物組織培養(yǎng)的理論基礎植物組織培養(yǎng)實驗材料的清洗與消毒培養(yǎng)基接種種質保存植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術

植物組織培養(yǎng)的理論基礎植物的無性繁殖：不經過雌雄配子的結合，通過母體的部分組織或器官來進行繁殖的方式。特點：不發(fā)生遺傳重組，后代與親代在遺傳上完全一致優(yōu)點：短期內獲得大量的后代

植物組織培養(yǎng)的理論基礎植物細胞全能性(totopotent)理論：植物體的每一個細胞都含有整株植物的全部遺傳信息，都有分化成一個完整植株的潛在能力。

植物組織培養(yǎng)的理論基礎細胞分化(differentiation)：細胞后代在形態(tài)結構和功能上發(fā)生差異的過程。細胞在分化過程中，經歷全能性-多能性-單能性-成熟定型細胞分化的細胞一般不在分裂分化表現在細胞多個方面的差異

植物組織培養(yǎng)的理論基礎細胞的脫分化(dedifferentiation)：分化的細胞在一定條件下，可以轉變?yōu)榕咝约毎匦芦@得分裂能力。愈傷組織：脫分化的細胞經過細胞分裂，產生無組織結構、無明顯極性、松散的細胞團靜止細胞被活化：代謝活動迅速增加、細胞質增加、胞質流動活躍、核糖體大量累積、蛋白質合成旺盛、RNA含量迅速增加。植物組織培養(yǎng)的理論基礎細胞的再分化和器官發(fā)生細胞的再分化(redifferentiation)：脫分化后的分生細胞在一定條件下，重新分化為各種類型的細胞，并進一步發(fā)育成完整植株愈傷組織再分化形成再生植株的途徑：器官發(fā)生途徑：愈傷組織誘導形成器官，再形成完整植株（先根后芽或先芽后根）胚狀體發(fā)生途徑：由愈傷組織誘導形成類似種子的胚的結構，同時產生芽端和根端的結構，稱胚狀體。經過與合子胚相似的發(fā)育過程，形成完整植株。

植物組織培養(yǎng)的理論基礎胚狀體類型體細胞胚、生殖細胞胚

植物組織培養(yǎng)的理論基礎分化期細胞在生理、生化方面有劇烈的變化酶的活性增強、營養(yǎng)物質累積、RNA和組蛋白的合成速度加快分化期細胞的形態(tài)大小保持相對穩(wěn)定，愈傷組織不再增殖，細胞由平周分裂轉變?yōu)榻M織內部局部的分裂，形成“瘤狀”或“片狀”的分生組織結構。

植物組織培養(yǎng)的理論基礎影響植物細胞脫分化和再分化的因素內部因子：遺傳性狀、生理狀況外部因子：營養(yǎng)條件、環(huán)境條件植物組織培養(yǎng)的理論基礎植物激素在植物細胞分化和再分化中的作用激素在細胞分化中起著重要的有時是決定性的作用生長素是植物脫分化培養(yǎng)基中不可缺少的成分生長素作用機制：可以與組蛋白結合，活化相關基因的表達，啟動細胞分裂2，4-D作用：啟動細胞脫分化，形成胚性細胞團廣泛應用于誘導各種愈傷組織的培養(yǎng)基中細胞分裂素作用：能夠維持并促進脫分化細胞分裂

植物組織培養(yǎng)的理論基礎植物激素在植物細胞分化和再分化中的作用生長素、分裂素是植物細胞再分化中不可缺少的激素生長素能促進植物根的形成并抑制芽的形成生長素/細胞分裂素的比例，影響愈傷組織的生長和器官的發(fā)生植物組織培養(yǎng)的理論基礎其它影響植物細胞脫分化和再分化的條件機械和生理隔離對植物細胞的脫分化和再分化非常重要原因：植物離體培養(yǎng)將培養(yǎng)的細胞、組織、器官從植物體上分離下來，解除制約，從而使之恢復到分生組織狀態(tài)切割創(chuàng)傷誘導產生的一些物質也可能影響到基因的表達，改變植物的代謝途徑，朝向胚性細胞的方向發(fā)展

植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)：在含有營養(yǎng)物質及植物生長物質的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)離體植物組織并誘導使其長成完整植株的技術。

植物組織培養(yǎng)離體培養(yǎng)的細胞、組織或器官發(fā)育成完整植株方式體細胞胚胎發(fā)生器官形成

實驗材料的清洗和消毒清洗自來水流水沖洗5分鐘，用中性洗衣粉液清洗，自來水流水沖洗30分

實驗材料的清洗和消毒消毒：藥劑滅毒法適用：培養(yǎng)材料的表面消毒藥劑選擇：根據培養(yǎng)材料的特點，選擇適合的藥劑種類、濃度、消毒時間消毒原則：即達到滅菌的目的，又不能損傷植物組織和細胞各種藥劑的使用濃度和浸泡時間應依據植物種類和取用的器官部位不同進行滅菌實驗材料的清洗和消毒具體情況：具有較厚蠟質和角質層的材料，在藥劑滅菌時加入少量表面活性劑器官外植體滅菌，一般采用多種藥劑配合使用的方法如果外植體較硬較大，容易操作，可直接用滅菌劑處理未成熟胚珠、胚或胚乳，分別把子房或胚珠進行表面消毒，然后在無菌條件下把外植體解剖出來

實驗材料的清洗和消毒具體情況：柔嫩的莖尖、花粉粒，莖芽、花蕾表面消毒，無菌條件下取出外植體殺菌劑處理之前，先用75%的酒精浸泡30秒，或在消毒溶液里加幾滴表面活化劑，提高殺菌效果表面消毒處理后，必須在無菌蒸餾水中漂洗3-4次，除掉殘留的殺菌劑外植體表面污染嚴重，須先用流水沖洗1小時或更長時間

培養(yǎng)基是植物細胞、組織、器官離體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)物質，含有植物細胞生長分化所必須的各種營養(yǎng)成分和生長調節(jié)物質。對培養(yǎng)基成分的篩選和優(yōu)化是植物組織培養(yǎng)中非常重要步驟

培養(yǎng)基早期的植物組織培養(yǎng)基是White提出的培養(yǎng)基和Gautheret提出的愈傷組織培養(yǎng)基，由用于整體植物栽培的營養(yǎng)液發(fā)展來以后所有的各種培養(yǎng)基都是建立在White培養(yǎng)基和Gautheret培養(yǎng)基基礎上的。

培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成無機營養(yǎng)成分大量元素：氮、磷、硫、鈣、鉀、鎂>0.5mmol/L微量元素：鐵、錳、銅、鋅、硼、鉬<0.5mmol/L常用培養(yǎng)基組分上的主要差別：各種鹽或離子數量上的不同各種植物組織所需要的無機鹽營養(yǎng)在質上是相當一致的。培養(yǎng)基中的活性因子就是這些離子

培養(yǎng)基培養(yǎng)基的組成無機營養(yǎng)成分鐵：Fe·EDTA無機氮：硝酸鹽、銨鹽

培養(yǎng)基-有機營養(yǎng)成分植物離體細胞分裂和分化所必需的有機碳、氫、氮、能量是以糖類、氨基酸、維生素的形式提供的。碳源：最常用的碳源是蔗糖，濃度2%-5%含氮物質：維生素（硫胺素、吡哆醇、煙酸、泛酸鈣、肌醇）；化學成分不明的復雜營養(yǎng)混合物（椰子汁、玉米胚乳、麥芽浸出物、番茄汁、酵母浸出物）

培養(yǎng)基-植物激素類生長素自然界中，影響莖和節(jié)間的生長、向性、頂端優(yōu)勢、葉片脫落、生根；組織培養(yǎng)中用于誘導細胞的分裂和根的分化常用的生長素：IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚-3-丁酸)、NAA(萘乙酸)、2，4-D(二氯苯氧乙酸)等

培養(yǎng)基-植物激素類細胞分裂素類自然界中，影響細胞分裂、頂端優(yōu)勢的分化和莖的分化組織培養(yǎng)中，促進細胞分裂和由愈傷組織或器官上分化不定芽常用細胞分裂素：BAP(卞氧基嘌呤)、激動素等赤霉素刺激在培養(yǎng)中形成的不定胚正常發(fā)育成小植株常用的是GA3

培養(yǎng)基-瓊脂瓊脂是一種由海藻得來多糖類物質。瓊脂的一般使用濃度是0.7%-1%瓊脂并非培養(yǎng)基中必需成分

培養(yǎng)基的選擇不同的試驗體系需要不同的培養(yǎng)基，一種適合某種培養(yǎng)目的的培養(yǎng)基成分，一般是在已被廣泛采用的基本培養(yǎng)基的基礎上，經過一系列的實驗確定的試驗生長調節(jié)物質最佳組合：生長素、細胞分裂素確定培養(yǎng)基鹽分濃度確定適合的蔗糖濃度

培養(yǎng)基的制備市售培養(yǎng)基干粉按照配方規(guī)定的數量分別稱量出各種成分，分別溶解于水，然后再混合在一起先配制一系列的濃縮儲備液（母液），包括大量元素、微量元素、鐵鹽、除蔗糖外的有機物質

培養(yǎng)基的制備步驟稱量瓊脂和蔗糖，加熱溶解加入一定量的各種儲備液加蒸餾水至終體積調節(jié)PH值分裝包裝、滅菌保存

培養(yǎng)基的滅菌高壓蒸汽滅菌：適用于固體培養(yǎng)基過濾除菌：適用于液體培養(yǎng)基

接種經過表面滅菌的實驗材料，按照不同的要求，移植培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程。步驟消毒無菌水清洗無菌器具切取外植體接種到培養(yǎng)基

種質保存

許多植物的組織培養(yǎng)物在液氮中超低溫保存以后，仍然能保持很高的存活率，并且能再生出新植株和保持原來的遺傳特性保存方法材料的選擇，預處理，降溫冰凍，解凍，活力測定，再培養(yǎng)

種質保存超低溫保存的意義：能保持細胞培養(yǎng)物的穩(wěn)定性長期保存植物的種質資源長期保存農作物的優(yōu)良品種及其育種親本材料的種質

植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的產業(yè)化前景植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)系統攪拌式生物反