3食品中致病菌快速檢測方法熒光PCR法綠假單胞菌的熒光PCR定性檢測方法，包括方法的原理、試劑cholerae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的熒光PCR快速定性檢測。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格3.1熒光PCR法（Fluorescence43.24縮略語DNA：脫氧核糖核酸(DeoxyriboNucleicAcid)PCR:聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReactdNTP:脫氧核苷三磷酸（Deoxy-ribonucledATP:脫氧腺苷三磷酸（DeoxyadenosineTriphdGTP:脫氧鳥苷三磷酸（DeoxyadenosinetriphodCTP:去氧胞苷二磷酸（DeoxycytidinediphosdTTP:脫氧胸苷三磷酸（DeoxythdUTP:脫氧尿苷三磷酸（DeoxyuridinetriphoTris:三（羥甲基）氨基甲烷（Tris(hydroxymetTaq酶:Taq聚合酶（TaqpolymeUNG酶:尿嘧啶-N-糖基化酶（Uracil-N-Glycosylase）方法。選取目標(biāo)菌屬的特異性基因序列設(shè)計引物和具關(guān)系，當(dāng)熒光信號強度達到或超過設(shè)定閾值時，確定CT值，表示該DNA模板有特異性基因序列，以此可判定樣品中目標(biāo)菌的檢出與否。除非另有規(guī)定，所用試劑均采用分析純。檢測用水符合GB/T66826.5小腸結(jié)腸耶爾森氏菌檢測試6.8單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測試劑盒（凍干型PCR-熒光探針法）6.9腸出血性大腸埃希氏菌O157:H7檢測試劑盒（凍干型PCR-熒光探針法）6.27Tris-EDTA緩沖液：Tris-HCl（10-50mM（pH8.0））6.30引物和探針：針對目標(biāo)基因序列6.31Taq酶：耐高溫的TaqDNA聚合6.32dNTPs：脫氧核苷三磷酸混合6.33陽性對照：已知含有目標(biāo)基因序列的6.34陰性對照：不含目標(biāo)基因注：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒組成參照附錄A；凍干型PCR-熒光探針法試劑盒組成7.1冰箱：2℃~8℃、-20℃7.3恒溫培養(yǎng)箱/恒溫水浴鍋：41.5℃±1℃7.5微需氧培養(yǎng)裝置：提供微需氧條件（5%氧氣、10%二氧化碳和85%氮氣）7.9無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm679樣品前處理9.2DNA模板提取R9.3熒光PCR反應(yīng)體系制備添加量(μL）MgCl28UNG酶//111230s（熒光采集FAM通道10.2對照設(shè)置911.2結(jié)果判定樣品CT值≤35，且有典型的擴增曲線，則判定結(jié)果樣品35＜CT值＜40，應(yīng)重做樣品再次驗證，若CT值仍11.3陽性結(jié)果驗證及報告確定初步檢驗結(jié)果為陽性的，對樣品的增菌液或可疑菌落進一步按照國標(biāo)方法或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法操1）混合增菌液：取100ul菌液至裂解液L管中，蓋蓋，搖勻（生物安全柜或超凈工作臺中操作心1min，棄去收集管中的濾液，裝回吸附柱；5）洗脫：加入50μL的洗脫液至吸附柱膜中央，靜置3min后12000rpm離心1min，棄去吸附柱，將反應(yīng)管放入儀器中，設(shè)置樣品、參數(shù)及熒光采集通道：FAM-沙門氏菌，反應(yīng)體系設(shè)置為15μL，注：以“康澤睿檢”PCR檢測試劑盒系列品牌為例；其他熒光PCR檢測試劑盒參照附錄B內(nèi)容。F:GCGGCGTTGGAGAGTGAR:AGCAATGGAAAAAGCAGGATGP:FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-BHQ1F:CGCAATACCTCCGGATTR:TCCGCAGAGGCACTGAGP:FAM-AACAGGTCGCTGCATGGCTGGAA-BHQ1（Vibrioparahaemolyticus）F:GCGACCTTTCTCTGAAATATTAATTGTR:CATTCGCGTGGCAAACAP:FAM-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-BHF:AAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAR:TTCTGCGAGTAACGTCAATCAP:FAM-ATTAACCTTTATGCCTTCCTCCTCGCTG-BHQ1（Campylobacterjejuni）F:TTGGTATGGCTATAGGAACTCTTATAGCTR:CACACCTGAAGTATGAAGTGGTCTAAGTP:FAM-ATGGCATATCCTAATTTA-MGBF:TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCAR:GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGP:FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-BHQ1F:CTGAATCTCAAGCAAAACCTGR:CGCGACCGAAGCCAACP:FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-BHF:TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTR:ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTP:FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-BHQ1F:TGTTTATGGTGAGAACGGTGAR:TTCTTTATCTAGGCCCCAAAP:FAM-CCGTTAACCGAACCACCCGCAA-BHQ1F:GCTTTATTGTTCGATGCGTTA