DB21ICS65.020.40遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)DB21/T3153—2019榿葉唐棣組培育苗技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationontissuecultureandseedlingbreedingforAmelanchieralnifoliaNutt.遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局I目次前言................................................................................III榿葉唐棣組培育苗技術(shù)規(guī)程..................................................................11范圍.....................................................................................12規(guī)范性引用文件...........................................................................13術(shù)語(yǔ)和定義...............................................................................14生產(chǎn)設(shè)備及化學(xué)試劑.......................................................................25生產(chǎn)環(huán)境及設(shè)備的消毒滅菌.................................................................36培養(yǎng)基制作...............................................................................47外植體處理方法...........................................................................58組織培養(yǎng).................................................................................59定植.....................................................................................8附錄A.....................................................................................9（資料性附錄）............................................................................9榿葉唐棣形態(tài)特征和生物學(xué)特性..............................................................9附錄B....................................................................................10（資料性附錄）...........................................................................10B.1MS培養(yǎng)基母液的配制表.................................................................10附錄C....................................................................................11（規(guī)范性附錄）...........................................................................11表C.1常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配制表.........................................................11前言本標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C均為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省林業(yè)和草原局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省農(nóng)林旱地研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：黃立華、王占龍、朱虹、龍忠偉、鄭璐、尚福強(qiáng)、趙興秋、蔡靜、鹿天閣、孟春雷、于欣、王艷輝、王鵬、王玉峰、金亞榮、王春麗、王孝軍、董立軍、劉杰、李在芬、王玉峰、步兆東。ⅡDB21/T3153—2019榿葉唐棣組培育苗技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了榿葉唐棣（AmelanchieralnifoliaNutt.)組培育苗技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、生產(chǎn)設(shè)備及化學(xué)試劑、生產(chǎn)環(huán)境及設(shè)備的消毒滅菌、培養(yǎng)基制作、外植體處理方法、組織培養(yǎng)程序、定植等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于遼寧省榿葉唐棣組培快繁育苗。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB1882林木組織培養(yǎng)育苗技術(shù)規(guī)程GB4285農(nóng)藥安全使用標(biāo)準(zhǔn)GB/T8321農(nóng)藥合理使用準(zhǔn)則3術(shù)語(yǔ)和定義榿葉唐棣Saskatoonberry薔薇科（Rosaceae）唐棣屬落葉灌木或小喬木。原產(chǎn)于北美洲從美國(guó)阿拉斯加州至橫穿加拿大西部的大部分地區(qū)以及美國(guó)中西部和中北部地區(qū)，其生長(zhǎng)地勢(shì)從北部的海平面一直到加利福尼亞州海拔2600m甚至落基山脈海拔3400m的高度。榿葉唐棣較喜光，尤其是果實(shí)成熟期需要大量的陽(yáng)光，同時(shí)具有抗寒、耐旱、對(duì)氣候和土壤適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，能適應(yīng)大多數(shù)土壤類型如栗鈣土、黑鈣土、褐色土和棕壤等。原生地氣候條件為亞寒帶和溫帶大陸性干旱、半干旱氣候，年均氣溫-3.2℃～9.4℃，無霜期80～120d，能適應(yīng)冬季-40℃嚴(yán)寒。1DB21/T3153—2019將繼代培養(yǎng)產(chǎn)生的無根芽苗接種到生根培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)生根得到完整的試管植株的過程。3.4試管苗seedlinginvitro培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中無污染的，具有根、莖、葉的完整植株。3.5煉苗Acclimatization將試管苗移至日光溫室或大棚進(jìn)行強(qiáng)光鍛煉。3.6移栽transplanting在設(shè)施育苗情況下，將試管苗從培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)移到瓶外，采取降溫、控水等措施進(jìn)行逐步鍛煉的過程，使其定植后能適應(yīng)露地的不良環(huán)境條件。3.7褐化brown外植體在離體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物從傷口處分泌褐色物質(zhì)進(jìn)而導(dǎo)致自身長(zhǎng)勢(shì)不佳甚至死亡的現(xiàn)象。在組織培養(yǎng)過程中，試管苗生長(zhǎng)異常，葉、嫩梢呈水晶透明或半透明、水浸狀；整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎。增殖系數(shù)proliferationcoefficient外植體再生形成的芽的平均數(shù)。3.10將移栽成活后的試管苗移到圃地的過程。4生產(chǎn)設(shè)備及化學(xué)試劑超凈工作臺(tái)、解剖刀、鑷子、酒精燈、醫(yī)用小推車、廣口瓶、白瓷碟、無菌濾紙。2DB21/T3153—20194.3滅菌設(shè)備高壓蒸汽滅菌鍋、紫外線燈、烘干箱4.4滅菌藥劑及輔助劑75%酒精、90%酒精、0.1%升汞、高錳酸鉀、甲醛、84消毒液、洗衣粉、洗滌靈等。4.5培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑MS培養(yǎng)基、6-芐氨基嘌呤、奈乙酸、吲哚丁酸、白糖、瓊脂等。4.6培養(yǎng)設(shè)備300ml培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)架、空調(diào)、照明燈管。4.7試驗(yàn)設(shè)備冰箱、電子天平、（0.01mg、0.001mg）、磁力攪拌器、酸度計(jì)、照度計(jì)、溫濕度表、移液槍、移液管、試劑瓶、容量瓶、燒杯等。5生產(chǎn)環(huán)境及設(shè)備的消毒滅菌5.1培養(yǎng)瓶清洗與消毒將使用過的培養(yǎng)瓶或盛培養(yǎng)基的玻璃器皿中污物如培養(yǎng)基、培養(yǎng)物倒掉，再浸入水中，然后洗滌。有微生物污染的器皿，必須先進(jìn)行高壓消毒和煮沸，殺死菌體后進(jìn)入水中洗滌。器皿洗凈后，烘干或晾干，放在規(guī)定的地方，以待取用。使用前接種器械、器皿及定性濾紙用牛皮紙包裹后再用聚丙烯薄膜裹緊、包扎。將分裝好的培養(yǎng)基和接種用具放入高壓鍋的消毒桶內(nèi)，鍋內(nèi)滅菌物不超過鍋容量的3/4為宜，高壓滅菌時(shí)鍋內(nèi)使用蒸餾水。打開電源加熱，壓力保持在0.105MPa～0.12MPa（注意壓力不要超過0.14MPa），時(shí)間為30min。在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入250ml～500ml的裝有75%酒精的廣口瓶中，使用之前取3DB21/T3153—2019房間關(guān)閉緊密，將甲醛置于廣口容器中，加高錳酸鉀氧化揮發(fā)，熏蒸2d～3d,通風(fēng)無味后2d～3d人員方可進(jìn)入。接種室每30d用高錳酸及甲醛混合熏蒸，培養(yǎng)室每60d用高錳酸及甲醛混合熏蒸。工作期間每3d用75%酒精噴霧消毒。5.6無菌操作(a)進(jìn)入無菌室前，洗手，去掉指甲中的污物。(b)入室時(shí)換上經(jīng)過消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。工作人員操作前用75%的酒精擦洗雙手，操作中需經(jīng)常用酒精擦洗手。(c)操作前用75%酒精擦拭操作臺(tái)臺(tái)面及內(nèi)壁。(d)操作時(shí)，右手拿培養(yǎng)瓶，左手輕輕拉開瓶口綁繩放在臺(tái)面上，左手中指和無名指夾住封口膜后掀開，將培養(yǎng)瓶口傾斜靠近酒精燈火焰上旋轉(zhuǎn)灼燒瓶口數(shù)秒，用灼燒消毒冷卻后的鑷子將轉(zhuǎn)接材料接種到培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)容器中接種小芽叢或單芽的數(shù)量為3株～4株，且分布均勻，接種后蓋上封口膜包扎，并標(biāo)注日期。(e)接種時(shí)，在無菌濾紙上切取材料，刀和鑷子等接種工具，使用一次即放入75%酒精中浸泡，然后灼燒放涼備用。(f)接種時(shí)，超凈工作臺(tái)上的風(fēng)機(jī)要始終保持開啟狀態(tài)，確保通風(fēng)順暢。(g)操作過程中不準(zhǔn)講話，亦不準(zhǔn)對(duì)著操作區(qū)呼吸。(h)每次接種完畢后，用75%酒精將工作臺(tái)臺(tái)面及內(nèi)壁擦拭干凈，并將接種器皿及接種工具重新進(jìn)行消6培養(yǎng)基制作選用試劑純度為分析純的化學(xué)藥品，根據(jù)MS培養(yǎng)基配方，分別配制大量元素（10倍）、微量元素（100倍）、鐵鹽（100倍）、有機(jī)物（100倍），母液配制使用蒸餾水或去離子水。MS培養(yǎng)基母液配制比例參見附錄B。培養(yǎng)基母液分別貼上標(biāo)簽，標(biāo)注名稱、配制倍數(shù)和日期，置于0℃～4℃保存。鐵鹽應(yīng)儲(chǔ)存在棕色容器先用0.1mol·L-1的鹽酸或95%酒精溶解，然后加少量蒸餾水定容。具體配制方法和濃度參見附錄C。6.2.2保存4DB21/T3153—20196.3培養(yǎng)基配制、滅菌及保存6.3.1培養(yǎng)基配制根據(jù)培養(yǎng)基配方需求，稱量瓊脂（8g·L-1）、白糖（30～35g·L-1）,用70%～80%最終體積的水加熱溶解，然后按計(jì)算量依次加入MS母液、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，定容后用0.1mol·LNaOH溶液或0.1mol·L鹽酸-1-1溶液調(diào)節(jié)pH值（5.5～5.8），定量分裝至培養(yǎng)瓶中并封口、標(biāo)記。6.3.2培養(yǎng)基滅菌瓶裝培養(yǎng)基應(yīng)在12h內(nèi)完成滅菌程序，滅菌方式采用高壓蒸汽滅菌，在壓力0.105MPa、溫度121℃條件下滅菌15min～20min。操作方法同5.2.1。6.3.3培養(yǎng)基保存滅菌后的培養(yǎng)基放入接種室，避光、防塵保存。常溫條件下7d內(nèi)使用，2℃～4℃條件下14d內(nèi)使用完。7外植體處理方法7.1外植體采集生長(zhǎng)旺季（6月初～7月末），在晴天或露水干后剪取母株當(dāng)年生長(zhǎng)健壯的枝條作為外植體。外植體宜當(dāng)天采集，當(dāng)天處理，運(yùn)輸過程要保證低溫、保濕，迅速帶回組培室。7.2外植體莖段修剪修剪好的莖段按木質(zhì)化程度放置于不同的燒杯中，加入洗滌靈進(jìn)行表面沖洗，洗好后沖洗掉泡沫，放稱取1g升汞，加蒸餾水溶解，定容至1L，裝入棕色瓶中，用封口膜扎緊瓶蓋，貼上標(biāo)簽，標(biāo)明配制濃度、日期。使用的升汞消毒液應(yīng)按照國(guó)家有關(guān)劇毒化學(xué)藥品使用的法規(guī)進(jìn)行處理，可參見《醫(yī)療用毒性藥品管理辦法》（中華人民共和國(guó)國(guó)務(wù)院第23號(hào)令）。見附錄D。將純凈水裝入玻璃瓶中，扎緊封口膜，放入高壓鍋內(nèi)滅菌，保持鍋內(nèi)氣壓在0.105MPa～0.12MPa（121℃～123℃），30min。用75%酒精浸泡30s，無菌水沖洗2次～3次，然后按材料的木質(zhì)化程度，分別用0.1%升汞浸泡6min～8min，最后用無菌水沖洗5次～6次。8組織培養(yǎng)5DB21/T3153—20198.1.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA0.6mg·L-1-1-1-1-1+NAA0.12mg·L+IBA1.4mg·L+糖35g·L+瓊脂8g·L8.1.1外植體接種用手術(shù)刀從外植體上切下完整的腋芽，按照正常生長(zhǎng)方向接入腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)芽。8.1.2培養(yǎng)條件培養(yǎng)室溫度設(shè)定為25±2℃。光照強(qiáng)度為2500lx～3000lx，每天照射14h～16h。8.1.3培養(yǎng)周期40d～50d。8.1.4褐化苗處理發(fā)現(xiàn)組培苗出現(xiàn)褐化現(xiàn)象后，立即采取以下措施，直至褐化現(xiàn)象完全消失。(1)關(guān)閉照明電源，進(jìn)行暗培養(yǎng)。(2)降低培養(yǎng)室溫度至15℃～20℃。(3)將褐變苗轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基，然后每天繼續(xù)轉(zhuǎn)接一次至新培養(yǎng)基，連續(xù)轉(zhuǎn)接7d。8.2繼代增殖8.2.1培養(yǎng)基配方MS+BA2.5mg·L+IBA1.0mg·L+糖35g·L+瓊脂8g·L。-1-1-1當(dāng)初代誘導(dǎo)的不定芽長(zhǎng)到1.5cm或以上時(shí)，將萌發(fā)的幼芽從基部切下，去掉莖尖，并接種到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽的增殖培養(yǎng)。6DB21/T3153—20191/2MS+NAA1.5mg·L8.3.1生根苗接種將1.5cm以上、生長(zhǎng)健壯的不定芽切成單芽接種在生根培養(yǎng)基中。8.3.2接種株數(shù)每瓶接種10～15株，具體株數(shù)視培養(yǎng)瓶直徑確定，以不影響組培苗生長(zhǎng)為限。8.3.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件同8.1.2。8.3.4生根率生根率≧90%。8.3.5培養(yǎng)周期+IBA1.5mg·L+糖30g·L+瓊脂8g·L。-1-1-1-145d～60d。8.3.6生根苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)葉片綠色，株高≧3.0cm，根莖粗≧0.1cm，節(jié)間2～3個(gè)，單株復(fù)葉≧4片，根白柔軟，根數(shù)≧6條，平均根長(zhǎng)1.5cm～2.0cm。8.4煉苗4月～6月或8月～9月。基質(zhì)過篩后混勻，混勻過程中噴灑0.2%代森錳鋅水溶液消毒，混勻后堆漚覆膜、壓嚴(yán)，3ｄ后裝杯。7DB21/T3153—2019移栽前，用自來水把根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，用0.1%的多菌靈溶液浸泡組培苗根部3s～5s后栽入已準(zhǔn)備好的營(yíng)養(yǎng)缽中。8.8移栽管理8.8.1溫度管理通過遮陽(yáng)網(wǎng)、噴水、濕簾等因地制宜措施，將環(huán)境溫度控制在30±2℃。8.8.2濕度管理栽完一個(gè)苗床，澆定根水后搭建高50cm、寬1.2ｍ、長(zhǎng)6.0m的塑料小拱棚。移栽后前3d每天早晚各噴一次水，保持80%～90%的空氣濕度。3d后逐漸揭膜通風(fēng)直至完全去除塑料薄膜。8.8.3光照管理移栽后的前20d用遮光率為75%的遮陽(yáng)網(wǎng)進(jìn)行遮蔭，20d后逐漸卷起遮陽(yáng)網(wǎng)增加透光率，直至完全去掉遮陽(yáng)網(wǎng)。8.8.4根腐病防治栽后馬上噴施1：1：100的波爾多液預(yù)防，以后每7d再噴施1次。發(fā)病初期用采用0.1%的甲基托布津或0.1%的多菌靈溶液交替噴灑根莖部，連續(xù)防治2次～3次，間隔7d。噴施0.1%毒殺蜱，連續(xù)防治2次～3次，間隔7d。農(nóng)藥使用應(yīng)符合GB4285和GB/T8321(所有部分的規(guī)定)移栽20d后，葉面噴施0.3%的磷酸二氫鉀。移栽30d后，配合澆水，水中適量加入磷酸二銨。也可每20d噴施MS母液80～100倍液。肥料使用具體按NY/T489執(zhí)行。9定植8DB21/T3153—2019附錄A（資料性附錄）榿葉唐棣形態(tài)特征和生物學(xué)特性A.1分布榿葉唐棣是北美洲的鄉(xiāng)土樹種，分布范圍十分廣泛，北到加拿大的育空地區(qū)，南到美國(guó)的新墨西哥州，東到五大湖，西到美國(guó)阿拉斯加，幾乎占北美洲2/3區(qū)域，約橫穿了30個(gè)緯度。目前歐洲的英國(guó)、俄羅斯等國(guó)有栽培，我國(guó)為首次引進(jìn)。A.2形態(tài)特征落葉叢生的灌木或小喬木，樹高1m～4m，樹皮褐黑色，小枝呈褐色或灰白色，葉互生，橢圓狀倒卵形或橢圓狀，先端急尖或短漸尖，基部寬楔形，邊緣有細(xì)鋸齒，無毛，網(wǎng)脈不明顯；葉柄短，長(zhǎng)約0.2cm～0.3cm；托葉條形，邊緣有腺齒?？偁顐惴炕ㄐ蚧驈?fù)傘房花序，直徑3cm～5cm，花瓣線狀圓形、花萼筒狀，初外被白色絨毛，后逐漸脫落。漿果狀梨果，，果實(shí)球形，直徑約5mm～15mm，成熟時(shí)紫黑色，果肉外部紅褐色，內(nèi)部乳白色，汁液紅褐色。榿葉唐棣較喜光，果實(shí)成熟期需要大量的陽(yáng)光，抗寒、耐旱、對(duì)氣候和土壤適應(yīng)性強(qiáng)，能適應(yīng)大多數(shù)土壤類型如栗鈣土、黑鈣土、褐色土和棕壤等。原生地氣候條件為亞寒帶和溫帶大陸性干旱、半干旱氣候，年均氣溫-3.2℃～9.4℃，無霜期80～120d，能適應(yīng)冬季-40℃嚴(yán)寒。適合我國(guó)長(zhǎng)江以北至黑龍江地區(qū)生長(zhǎng)。榿葉唐