第三章色譜分析法的應(yīng)用本章講授內(nèi)容包含經(jīng)典的薄層色譜、紙色譜和柱色譜分析的內(nèi)容；不包含GC和HPLC等現(xiàn)代色譜分析內(nèi)容（設(shè)立專題進(jìn)行講解）；聲明概念及原理還記得這是一種典型的什么色譜？？**按流動相狀態(tài)的不同，可分為氣相色譜法(GC)——柱色譜（現(xiàn)代分析）液相色譜法(LC)——柱色譜（經(jīng)典分析）超臨界流體色譜(SFC)——柱色譜（現(xiàn)代分析）**按操作形式可分為：薄層色譜：吸附、分配、離子交換、分子篩薄層。柱色譜：吸附、分配、離子交換、凝膠柱色譜。紙色譜：分配色譜。（現(xiàn)代分析）？第一節(jié)紙色譜一、基本原理紙色譜是以濾紙為支持物，以分配機(jī)理為主的色譜，主要用于多官能團(tuán)或高極性的親水化合物的分離，如醇類、羥基酸、氨基酸、糖類和黃酮類等。補(bǔ)充：反相色譜：流動相極性＞固定相極性正相色譜：流動相極性＜固定相極性紙色譜呢？紙色譜濾紙是由纖維素構(gòu)成，在水蒸汽飽和的空氣中，可吸附20%~25%的水分，其中約有6%~7%的吸附水通過氫鍵（hydrogenbonding）與纖維素的羥基結(jié)合，較難脫去。吸附水（結(jié)合水）——固定相濾紙——支持物（支持固定相）分離過程依賴于萃取原理而實(shí)現(xiàn)二、濾紙的要求與選擇濾紙的要求：紙色譜1.質(zhì)地細(xì)密，厚薄均勻，平整；2.透光度均勻，不得有污點(diǎn)；3.應(yīng)有一定的強(qiáng)度，濾紙對溶劑的滲透速度適當(dāng)；4.濾紙中不含有水溶性和有機(jī)溶劑可溶性雜質(zhì)；5.對氨基酸分析有干擾的銅、鐵的含量應(yīng)小于1.5和10mg/kg。什么樣的濾紙才能作為紙色譜用？常用濾紙：杭州新華造紙廠生產(chǎn)的定性濾紙、定量濾紙和層析濾紙，以新華1號濾紙最為普遍；新華3號濾紙較厚，適合大量點(diǎn)樣。進(jìn)口濾紙:使用最多的為英國造的沃特曼（Whatman）1號。紙色譜*濾紙的選擇：一般選擇中速濾紙。以正丁醇為主的展開劑(如BAW)，粘度較大，展開速度慢；以石油謎、氯仿為主的溶劑展開速度較快。結(jié)合實(shí)驗(yàn)要求來挑選快速、中速、慢速的濾紙。一般定性分析選用較薄的濾紙；制備選用厚質(zhì)濾紙。紙色譜*濾紙裁剪及注意事項(xiàng)：需要條形狀時(shí)，應(yīng)順著纖維排列的方向。在裁剪濾紙時(shí)，要把周邊裁剪整齊，不能留毛邊。還要注意防止手垢和汗?jié)n等雜質(zhì)污染濾紙。能否用手撕？紙色譜有傾斜上行法或垂直上行法兩種。上行法展開的距離一般為10~15cm，展開時(shí)間約30min左右，快者只需幾分鐘，慢者需2~3h。1.上行法三、展開方式（薄層色譜和紙色譜）紙色譜的上行展開法ab樣點(diǎn)朝上，展開劑從上向下通過薄層或?yàn)V紙。展開劑通過濾紙條或紗布條作為橋梁進(jìn)行轉(zhuǎn)移。展開劑受吸附和重力的雙重作用，展開較快。

2.下行法（不常用）特殊裝置紙色譜的下行展開法ACBBAabcdabcdC混合樣品用于某些復(fù)雜成分或Rf值較小的成分的展開

3.雙向展開**邊緣效應(yīng)：消除邊緣效應(yīng)的方法：1.將展開槽、紙或薄層板用展開劑蒸氣飽和；2.在層析缸內(nèi)壁貼上用展開劑浸濕的濾紙條；3.點(diǎn)樣位置距離邊緣一定距離。產(chǎn)生的原因？四、展開劑的選擇與配制*紙色譜溶劑系統(tǒng)的要求：被分離的物質(zhì)在該溶劑系統(tǒng)中比移值在0.05~0.85之間；分離兩個(gè)以上的混合物，相互間比移值最好大于0.05；檢測物質(zhì)純度時(shí)要求比移值最好在0.4～0.6之間；溶劑的任一組分均不與目標(biāo)物起化學(xué)反應(yīng)。紙色譜紙層析所得斑點(diǎn)要圓整；溶劑系統(tǒng)受溫度變化小，而且容易迅速達(dá)到平衡；展開系統(tǒng)的選擇原則：多用極性的混合溶劑，且其中之一是水。在選擇展開劑時(shí)，一般按照“相似相溶”原理進(jìn)行，多用BAW（Butanol:Acetic

acid:Water）；紙色譜若分離可溶于乙醇和水，且較易溶于乙醇的中等親水性物質(zhì)，采用中等含水量的溶劑系統(tǒng)。若分離易溶于水、但難溶于乙醇的強(qiáng)親水性物質(zhì)時(shí)，選含水量在10%~40%的高含水系統(tǒng)。對于難溶于水，但易溶于親脂性溶劑的物質(zhì)，則展開劑主要組分是苯、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯等。紙色譜分離酸性或堿性物質(zhì)時(shí)溶劑系統(tǒng)：由于酸或堿的電離平衡現(xiàn)象，展開時(shí)將產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。在溶劑中加入酸或堿來抑制弱酸或弱堿的電離;或在濾紙上噴緩沖鹽，以保持一定的pH值，干后再展開。必須注意：展開劑也須事先用緩沖液平衡后再使用。記得原因嗎？有其他原因嗎？紙色譜斑點(diǎn)拖尾現(xiàn)象形成的幾種原因：①點(diǎn)樣量過多，超過了濾紙溶劑的溶解能力。②物質(zhì)電離，導(dǎo)致Rf值差異。③被分離的物質(zhì)與濾紙上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等雜質(zhì)形成絡(luò)合物而形成拖尾，可改用純?yōu)V紙展開。④某些物質(zhì)在展開過程中分解，產(chǎn)物有不同的Rf值。五、操作步驟

確定并標(biāo)記點(diǎn)樣位置→點(diǎn)樣→濾紙飽和→展開→斑點(diǎn)檢出①點(diǎn)樣：

距底邊15~20mm，點(diǎn)間距離約為8~12mm，樣點(diǎn)直徑為1~3mm左右。點(diǎn)好樣品，風(fēng)干或吹風(fēng)機(jī)吹干。紙色譜②飽和與展開：

將濾紙懸吊于裝有展開劑的色譜缸中，用蓋蓋好，靜置1~2h后將點(diǎn)樣端垂直浸入展開劑中展開；溶劑的前沿升到接近濾紙頂端時(shí)，取出濾紙，立即用鉛筆畫出溶劑前沿所在位置，吹干。紙色譜③顯色：分為物理法和化學(xué)法兩種：紙色譜用噴壺距濾紙約30~40cm，向?yàn)V紙均勻噴灑顯色劑，以濾紙基本打濕為宜。然后用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)緩緩吹干并加熱濾紙，直到顯示出斑點(diǎn)為止?；瘜W(xué)法：一種或數(shù)種化學(xué)試劑與被檢出物質(zhì)反應(yīng)，生成有顏色的化合物，試劑叫顯色劑。物理法：非破壞性方法，特點(diǎn)是被撿物質(zhì)不發(fā)生化學(xué)變化，不被破壞。適用于雙向展開、多次展開、定位后掃描測定或洗脫定量等。紙色譜

1）紫外光：對未知化合物，展開后在用顯色劑以前，應(yīng)先在紫外燈下進(jìn)行察看。紫外光常用兩種波長254nm與365nm。2）碘：碘是一種非破壞性顯色劑，價(jià)廉易得，顯色迅速、靈敏。與物質(zhì)的反應(yīng)往往是可逆的。3）水：為非破壞性顯色劑，用于硅膠薄層，紙色譜不常用。紙色譜④測量Rf值與鑒定：用鉛筆將所有斑點(diǎn)的輪廓描出來，并確定出各斑點(diǎn)的中心位置。分別量出點(diǎn)樣點(diǎn)到溶劑前沿的距離和各斑點(diǎn)位置的距離，按照Rf值定義計(jì)算各斑點(diǎn)的Rf值。紙色譜紙色譜分離-可見分光光度法測定實(shí)例展開劑：水洗脫劑：95%乙醇分析波長：365nmC=0.04986A-8.0309×10-5；R=0.9994顯色劑：

5%NaNO2，10%Al(NO3)30.4mL，1mol/LNaOH可分為物理吸附和化學(xué)吸附:物理吸附是以分子間力相互吸引的，一般情況下吸附熱較小，如活性炭吸附氣體?；瘜W(xué)吸附是以類似于化學(xué)鍵的力相互吸引，被吸附的物質(zhì)往往發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，所以大都是不可逆的。范得華力1、吸附色譜按照原理注意：不可逆的反應(yīng)在色譜上不能用第二節(jié)薄層色譜固體對液體中溶質(zhì)或微粒的吸附作用，如在生產(chǎn)注射液的過程中，常用活性炭脫色。由于色素對活性炭的吸力要比溶劑對活性炭的吸附力大，所以色素能被吸附劑所吸附?！跋嗨葡嗳堋?？？水——極性水——極性水溶性成分

——極性薄層色譜不同物質(zhì)與吸附劑（固定相）之間的吸附力不同；不同物質(zhì)在溶劑（流動相）中的溶解度不同；當(dāng)達(dá)到吸附和溶解（解吸）平衡時(shí)，不同的物質(zhì)在固定相和流動相之間便具有不同的分配比或平衡常數(shù)（K）。當(dāng)流動相向前移動時(shí)，相當(dāng)于對成分進(jìn)行了一次富集。到達(dá)前方的各成分會在新位置于固定相和流動相之間重新形成平衡。同時(shí)，原位置殘留的各成分因新鮮溶劑的到來也會在原位置重新形成平衡。吸附薄層色譜：薄層色譜吸附劑可按其物理性質(zhì)分成極性和非極性吸附劑極性吸附劑：具親水特性，如氧化鋁、硅膠、活性白土等，適用于非極性或極性小的溶劑。非極性吸附劑：具有疏水特性，最好是從極性溶劑中吸附溶質(zhì)，典型吸附劑是活性炭。薄層色譜吸附劑可按其化學(xué)性質(zhì)分中性、酸性和堿性吸附劑酸性硅膠、鋁硅酸鹽屬酸性吸附劑氧化鋁、氧化鎂、氧化鈣屬堿性吸附劑

碳酸鈣、硫酸鈣和蔗糖等屬中性吸附劑

注意：某些氧化鋁為兩性化合物，經(jīng)酸或堿處理后易獲得另外的性質(zhì)薄層色譜根據(jù)吸附能力的大小或吸附量的大小可分成弱、中、強(qiáng)三種蔗糖＜淀粉＜滑石粉＜碳酸鈉活性硅酸鎂＜活性氧化鋁＜活性炭＜活性氧化鎂＜漂白土

碳酸鈣＜磷酸鈣＜磷酸鎂＜氧化鎂＜沉淀氫氧化鈣注意：酸性吸附劑容易吸附堿性物質(zhì)，酸性化合物易被一些堿性吸附劑所吸附

弱強(qiáng)中溶劑和吸附劑的關(guān)系比單純注意吸附劑的等級和活化度更重要在水溶液中，對于極性較低的化合物，若用硅膠或氧化鋁為吸附劑則效力很低，因?yàn)檫@時(shí)溶劑較溶質(zhì)更易于被吸附。這種情況下應(yīng)該用非極性的吸附劑，例如活性炭?；罨潭扰c吸附力吸附劑的性質(zhì)與吸附力吸附劑的種類與吸附力XDA-系列NK-系列X-系列

常用吸附劑的特性（1）氧化鋁：有堿性、中性和酸性三類，粒度規(guī)格大多為100～150目。堿性氧化鋁（pH9~10）：適用于堿性物質(zhì)（如胺、生物堿）和對酸敏感的樣品（如縮醛、糖苷等），也適用于烴類、甾體化合物等中性物質(zhì)的分離。酸性氧化鋁（pH3.5~4.5）：適用于酸性物質(zhì)如有機(jī)酸、氨基酸等以及色素和醛類化合物的分離。中性氧化鋁（pH7~7.5）：適用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定的物質(zhì)如酯、內(nèi)酯等的分離，也用來分離弱的有機(jī)酸和堿等。薄層色譜（2）硅膠：柱色譜用硅膠一般不含粘合劑。適用范圍：非極性和極性化合物，如芳香油、萜類、甾體、生物堿、強(qiáng)心甙、蒽醌類、酸性、酚性化合物、磷脂類、脂肪酸、氨基酸等。（3）聚酰胺：色譜用聚酰胺主要有錦綸6（聚己內(nèi)酰胺）和錦綸66（聚己二酰己二胺）兩種，分子量一般在16000～20000，親水性和親脂性均較好，既可分離水溶性成分，也可分離脂溶性成分?？扇苡跐恹}酸、甲酸及熱的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺，微溶于乙酸和苯酚，不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；對堿穩(wěn)定，對強(qiáng)酸可水解。薄層色譜2、離子交換色譜（IonExchangeChromatography）

離子交換是利用一種不溶性高分子化合物，其分子中具有解離性基團(tuán)（交換基），在水溶液中能與溶液中的其他陽離子或陰離子起交換作用。

交換反應(yīng)是平衡反應(yīng)，在層析柱上進(jìn)行時(shí)，由于連續(xù)添加新的交換溶液，平衡不斷向正反應(yīng)方進(jìn)行，直至完全，溶液中的離子不斷被交換而濃度逐漸減少，因此也可以全部被交換而吸著在交換劑上。薄層色譜離子交換樹脂主要可以分為：陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、兩性離子交換樹脂和絡(luò)合樹脂等。兩性離子交換樹脂和絡(luò)合樹脂在成分分離上不常用。根據(jù)解離性能大小，還可分為強(qiáng)、中、弱等。陽離子交換樹脂的解離性基團(tuán)是磺酸基（–SO3H）、磷酸（–

PO4H2）、羧酸（–

COOH）和酚羥基（–

OH）等酸性基團(tuán)。陰離子交換樹脂中含有季銨、伯、仲、叔胺等堿性基團(tuán)。薄層色譜1）強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂

①聚苯乙烯強(qiáng)酸型樹脂：是最常用的強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，以苯乙烯為單位，向上下左右延伸的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是它的母體。母體上連結(jié)許多-SO3H。薄層色譜②酚磺酸型樹脂：對羥基苯磺酸和甲醛縮合而成。一般為黑色，交換量比苯乙烯樹脂小，遇堿或氧化劑時(shí)，性能易變化，故應(yīng)用范圍較小。

薄層色譜2）強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂：樹脂的母體和苯乙烯強(qiáng)酸性樹脂相同，區(qū)別在于母體上連結(jié)有季銨。對酸、堿和有機(jī)溶劑亦較穩(wěn)定，但在濃硝酸中不穩(wěn)定。薄層色譜3）弱酸性陽離子交換樹脂：含有—COOH的樹脂，母體有芳香族和脂肪族兩種。脂肪族類型中用甲基丙烯酸和二乙烯基苯聚合的較多。

芳香族類型的用二羥基苯酸和甲醛聚合的較多。薄層色譜4）弱堿性陰離子交換樹脂：含有-NH2，-NH等基團(tuán)的陰離子交換樹脂。這種樹脂有黃、橙、黑等顏色。薄層色譜相當(dāng)于連續(xù)多次的液-液萃取。固定相和流動相均是液體，固定相的液體由其它固體材料（支持劑、載體或擔(dān)體）來支持或載附，不隨流動相的移動而移動。物質(zhì)的分離是依靠不同物質(zhì)在固定相和流動相之間以不同的分配系數(shù)（K）連續(xù)不斷地形成分配平衡而實(shí)現(xiàn)。3、分配薄層色譜：薄層色譜TLC（ThinLayerChromatography）：把吸附劑或支持劑鋪在玻璃板上，將樣品點(diǎn)在其上，然后用溶劑展開，使樣品中各個(gè)組分相互分離的方法。簡便、應(yīng)用范圍非常廣泛。分類：吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層、分子篩薄層等。主要介紹前兩種。按照操作形式二、基本概念薄層色譜1、Rf值物質(zhì)在薄層板上移動速度常用Rf值（比移值）表示，其定義是：薄層色譜

薄層的厚度

吸附劑的種類、粒度、活度（吸附能力）

展開劑的純度、組成及揮發(fā)性

展開方式（上行或下行）

展開缸的形狀、大小及飽和程度

外界溫度等薄層色譜影響Rf值的因素：薄層色譜在固定條件下，特定化合物的Rf值是一個(gè)常數(shù)。在條件完全相同的情況下，Rf值可以作為該化合物定性檢定的物理指標(biāo)，就像測定熔點(diǎn)或其它物理常數(shù)一樣。為了獲得相同的色譜條件，通常是把未知樣和標(biāo)準(zhǔn)樣同時(shí)滴加在同一塊薄板上。薄層色譜

Rf的特性和應(yīng)用：薄層色譜1、吸附色譜常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁，粒度一般為150~300目，其次是聚酰胺和纖維素，粒度一般分別為70~140目和160~200目。氧化鋁的極性比硅膠大，比較適用于分離極性較小的化合物（烴、醚、醛、酮、鹵代烴等）；相反，硅膠適用于分離極性較大的化合物（羧酸、醇、胺等）。非極性化合物在硅膠板上吸附較弱，分離較差，Rf值較大。三、吸附劑和支持劑

薄層色譜常見有機(jī)液體的極性次序?yàn)椋菏兔眩辑h(huán)己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜苯＜1,2-二氯乙烷＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜水＜乙酸。對于氧化鋁來說，吸附力由小到大的次序?yàn)椋何焱椋际兔眩技和椋辑h(huán)己烷＜四氯化碳＜苯＜乙醚＜氯仿＜二氯甲烷＜乙酸乙酯＜異丙醇＜乙醇＜甲醇＜乙酸。對于硅膠來說則為：環(huán)己烷＜石油醚＜戊烷＜四氯化碳＜苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜乙醇＜水＜丙酮＜乙酸＜甲醇。這種次序的局部顛倒現(xiàn)象可能是由更復(fù)雜的原因造成的。

2、分配色譜：支持劑：硅膠、硅藻土、纖維素等。固定相：水、甲酰胺、石蠟油等。薄層粘合劑及其他添加劑：石膏(10%

~15%)、羧甲基纖維素鈉(0.5%

~1%)、淀粉(5%)、聚乙烯醇（0.5%

~1%）等。硅膠G就是含13%

~15%石膏的制品。添加1.5%的硅酸鋅錳，制成熒光板。如市售的硅膠GF254。加入硝酸銀可制成硝酸銀薄板，用于分離含π鍵的順、反異構(gòu)體。添加硼酸制成的薄層板則可以分離單糖類化合物的赤式和蘇式異構(gòu)體。蘇式構(gòu)型和赤式構(gòu)型：（補(bǔ)充?。?/p>

與蘇阿糖構(gòu)型相似者為蘇式構(gòu)型；與赤蘚糖構(gòu)型相似者為赤式構(gòu)型。例：大原則：選擇展開劑需要針對吸附劑的種類、活度和被分離混合物的組成及各成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等情況綜合而定。小原則：被分離物質(zhì)和展開劑之間的極性關(guān)系應(yīng)符合“相似相溶原理”。該原則可用于確定展開劑的大致范圍。具體方法：粗選→預(yù)試驗(yàn)（小板試驗(yàn)）→確定四、展開劑及其選擇薄層色譜薄板的選擇最常用的薄板是玻璃板，其大小選擇根據(jù)目的、樣品量、組分的數(shù)目多少和展開的方式等綜合而定。小量制備：待分離組分總量在0.5~1g左右，可采用400mm×350mm的薄板1~3塊即可。預(yù)試或定性分析：用單項(xiàng)展開時(shí)，多用載玻片（200mm×50mm，200mm×25mm或75mm×25mm）。雙向展開一般采用200mm×200mm或400mm×200mm的大板。玻璃板要求：平整、光滑、干凈。薄層掃描用不能用玻璃板。五、基本操作

1．薄層板的選擇薄層色譜濕鋪法和干鋪法干鋪法2、制板方法：薄層色譜濕鋪法

概念：將溶劑或含粘合劑的溶劑和吸附劑按一定的比例，一般硅膠為30g/(75~90)ml，氧化鋁為25g/50ml，加到一起，調(diào)成糊狀，然后再將糊狀物均勻的鋪在薄板上的方法。薄層色譜濕鋪法操作步驟：①調(diào)糊②徒手鋪板：③質(zhì)量的判定：④后處理：晾干后，活化。薄層色譜濕鋪法的操作：①調(diào)糊硅膠G、氧化鋁G、硅膠GF254或不含粘合劑的吸附劑如硅膠H、氧化鋁H的充分調(diào)勻，均是取1份吸附劑，加入2~3份水。用CMC作粘合劑：0.5%羧甲基纖維素鈉溶液100ml，加硅膠H（200～250目）30g或氧化鋁50g，充分調(diào)勻后，即可涂鋪。用淀粉作粘合劑時(shí)：取硅膠H（200～250目）0.95份，加0.05份淀粉（可溶性淀粉不能用），加水2~3份，將容器放在沸水浴上加熱，不停攪拌下煮沸5分鐘，直到獲得最大的粘稠度，再加水1份，再煮1~2min，調(diào)勻，冷后涂鋪。纖維素粉：纖維素粉1份，加水（或丙酮）5～6份調(diào)成糊狀后涂鋪。聚酰胺1g，加6mL85%甲酸，攪拌溶解后，再加70%乙醇3mL，調(diào)勻后，便可涂鋪。薄層色譜②鋪板：將調(diào)制好的糊倒在備用的玻板上，用玻棒初步攤開，用拇指和食指抓住玻板一端，在桌面上反復(fù)震動數(shù)次，待薄層糊鋪展均勻后，平放在平臺上即可。適合微型板的制備。鋪板器：薄層色譜③薄層板質(zhì)量的判定：薄厚均勻，層面不應(yīng)有波紋，也不應(yīng)有透過吸附劑而看到玻璃板的斑點(diǎn)。④薄板的后處理：硅膠板一般在105℃,最高不超過128℃，烘箱中烘烤半小時(shí)，冷卻后取出在干燥器中保存?zhèn)溆?。作為分配色譜的硅膠薄層板無需活化，在室溫下放置12~24h后即可使用；氧化鋁板200~220℃活化4h，得活性為Ⅱ級的板。150~160℃活化4h，得活性為Ⅲ~Ⅳ級的板。薄層色譜3．點(diǎn)樣點(diǎn)樣的概念：點(diǎn)樣工具：微量注射器；毛細(xì)管。點(diǎn)樣方法：液體直接點(diǎn)樣法；固體添埋法。樣點(diǎn)式樣：點(diǎn)型；線型；條型。薄層色譜點(diǎn)樣應(yīng)注意的五個(gè)問題：點(diǎn)樣液的濃度：5%準(zhǔn)備液

0.1%~1%點(diǎn)樣液點(diǎn)樣斑點(diǎn)的大小：點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑不大于3mm；點(diǎn)樣量：

0.25mm薄層，幾微克~幾百微克，定性分析；

2mm薄層，可達(dá)幾十毫克~幾百毫克，制備。點(diǎn)樣位置：距底邊約1.5~2cm的起始線上，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離一般為1.5~2cm。薄層色譜展開/展層的概念：展層的容器：除專用的色譜缸外，玻璃標(biāo)本缸、染色缸、廣口瓶、大量筒、大試管等可代用。展層方式：上行法；下行法；雙向法等。4．展開/展層薄層色譜如成分本身有顏色，它們的位置馬上可以確定。5．顯色/檢出（定性、定量）芍藥大青葉薄層色譜物理法：非破壞性方法，特點(diǎn)是被撿物質(zhì)本身不發(fā)生化學(xué)變化，不被破壞，適用于雙向展開、多次展開、定位后掃描測定或洗脫定量等。1）定位方法（物理法和化學(xué)法）

1）紫外光：對未知化合物，展開后在用顯色劑以前，都應(yīng)先在紫外燈下進(jìn)行察看。紫外光常用兩種波長254nm與365nm，可根據(jù)具體情況來選擇。紫外光可單獨(dú)使用，也可與顯色劑配合使用。如果化合物能吸收紫外光同時(shí)又放出更長波長的光，即發(fā)出熒光，則也可用此熒光定位。人參黃柏2）碘：碘是一種非破壞性顯色劑，價(jià)廉易得，顯色迅速、靈敏。與物質(zhì)的反應(yīng)往往是可逆的。最簡單的顯色方法是在一個(gè)帶蓋的展開槽內(nèi)（其它密閉容器也可）、放幾粒碘晶體，展開后的薄層板在除去溶劑以后，放人盛碘容器內(nèi)，由于碘蒸氣可溶入許多有機(jī)化合物，致使斑點(diǎn)呈淡黃色或褐色。然后取出薄層板，劃出斑點(diǎn)輪廓。在空氣中放置一段時(shí)間，碘揮發(fā)，顏色就可以完全褪去。3）水：為一種非破壞性顯色劑，用于硅膠薄層。當(dāng)許多憎水性化合物展開后，用水噴薄層板，對光觀察，在半透明的薄層板上，顯出白色不透明的斑點(diǎn)。

化學(xué)法：一種或數(shù)種化學(xué)試劑與被檢出物質(zhì)反應(yīng)，生成有顏色的化合物，試劑叫顯色劑。直接噴霧法：√用一種噴霧器噴灑某種試劑溶液在紙或簿層表面使無色物質(zhì)顯色，是一種應(yīng)用極廣的方法。2）顯色的方法浸漬法：將展開后的薄層板浸入顯色劑中，使薄層板輕輕通過，干燥。顯色劑（通用顯色劑和專用顯色劑）：（i）硫酸（不適用于紙色譜）常用四種溶液：硫酸-水（1∶1）溶液；硫酸-甲醇或乙醇（1∶1）溶液；1.5mol/L硫酸溶液與0.5~1.5mol/L硫酸銨溶液。噴霧后，有的化合物立即反應(yīng)，但大多數(shù)化合物需加熱至105~130℃數(shù)分鐘才顯色，不同化合物的反應(yīng)不同，所顯顏色也往往各異。（ii）磷鉬酸溶液（不適用于紙色譜）常用5%磷鉬酸乙醇溶液，適用于多種有機(jī)化合物。噴后于120℃烘烤，還原性物質(zhì)均顯藍(lán)色。（通用顯色劑）（iii）高錳酸鉀溶液（不適用于紙色譜）

可作成0.05%堿性或中性溶液，與許多有機(jī)化合物反應(yīng)，在淡紅色背景上斑點(diǎn)顯黃色。如用高錳酸鉀-硝酸溶液，則背景為藍(lán)綠色，斑點(diǎn)顯黃色。（iv）熒光黃溶液常用0.05％熒光黃的50％甲醇溶液。噴霧后在紫外光下觀察，為芳香族與雜環(huán)化合物的通用顯色劑。專用顯色劑是指對某個(gè)或某一類化合物顯色的試劑，利用化合物本身的特有性質(zhì)，或利用其所含的某些官能團(tuán)的特殊反應(yīng)。（專用顯色劑）3.定量

一類為洗脫測定法，將所需測定的斑點(diǎn)中的組分用適當(dāng)溶劑洗脫，再選用適當(dāng)方法定量；另一類為直接測定法，色譜分離后，直接用肉眼觀察比較或用儀器掃描斑點(diǎn)而測定其含量。

3.1洗脫測定法

樣品經(jīng)色譜分離后，用適當(dāng)方法定出斑點(diǎn)位置，然后用溶劑將斑點(diǎn)中的化合物洗脫、測定。3.1.2對照法在同一張薄層板上隨同樣品點(diǎn)一個(gè)或幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。展開后，將所要測定樣品點(diǎn)的部分用玻璃板蓋住，對照用的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)用顯色劑噴霧顯色；由顯色后對照斑點(diǎn)的位置來確定未顯色樣品點(diǎn)部位中所要測定斑點(diǎn)的位置，再將該斑點(diǎn)中化合物洗脫測定。3.1.1直接定位法有色化合物直接定位，有熒光的化合物用紫外光定位，碘蒸汽顯色定位。3.1.3斑點(diǎn)的洗脫可以用小刀直接刮入容器中，然后用溶劑洗脫；用超聲波振蕩后，再離心，吸取上部清液進(jìn)行測定。也可將吸附劑直接劑顯色后，刮取，離心，取上清液測定。3.1.4測定

紫外分光光度法：用溶劑將斑點(diǎn)中化合物洗脫后調(diào)整至一定體積，在此化合物的最大吸收波長處進(jìn)行測定。注意對照的正確設(shè)置。比色法：選擇靈敏度高、專屬性好的比色試劑進(jìn)行反應(yīng)，在最大吸收波長下進(jìn)行比色。注意對照的正確設(shè)置。

3.2

直接測定法3.2.1目測法將所得斑點(diǎn)大小和顏色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下展開所得到的一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)斑點(diǎn)相比較，近似地判斷樣品中所測成分的含量。誤差較大。3.2.2

測面積法斑點(diǎn)面積A與樣品含量W間的關(guān)系符合下述的一種：

W—A；W—；logW—A；logW—；logW—logA

該方法誤差也較大。3.2.3

儀器測定法薄層可用光密度計(jì)（薄層掃描儀）（TLCScanner）掃描定量。近年來，由于儀器的不斷發(fā)展和完善，用薄層掃描儀測定斑點(diǎn)中化合物含量的方法已成為薄層定量的主要方法。薄層色譜六、薄層掃描儀1、測定原理薄層掃描法（TLCscanning）或薄層光密度法（TlCdensitometry）是用薄層掃描儀直接測定薄層板上斑點(diǎn)的吸光度（透射光或反射光強(qiáng)度）的定量方法，即利用薄層掃描儀對薄層板上的斑點(diǎn)直接掃描，透射光或反射光被光電倍增管接收，放大并轉(zhuǎn)換為電訊號，被記錄器記錄，由于斑點(diǎn)吸收了光，在記錄紙上呈現(xiàn)出一個(gè)峰，數(shù)據(jù)處理機(jī)自動記錄峰面積（或峰高）值，并計(jì)算出斑點(diǎn)中化合物的量。薄層色譜薄層色譜2．測量方法2．1透射法：單色光垂直照射在薄層表面，并透過斑點(diǎn)，測量透射光的強(qiáng)度，以測定斑點(diǎn)內(nèi)被測物質(zhì)的量。玻璃板吸收200~300nm的光，采用石英板測定紫外范圍，玻璃板測定可見范圍（300~700nm）。2．2反射法：單色光垂直照射薄層斑點(diǎn)后，測量其反射光的強(qiáng)度，以測定色點(diǎn)內(nèi)物質(zhì)的量。2．3熒光法：是以能激發(fā)熒光的物質(zhì)為對象，基線穩(wěn)定，峰面積與濃度在比較大的范圍內(nèi)成線性關(guān)系，具有專一性和靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。薄層色譜應(yīng)用實(shí)例：板藍(lán)根、大青葉中靛藍(lán)、靛玉紅的含量測定儀器：雙波長薄層掃描儀（KAMAGscanner3，瑞士卡瑪公司），半自動點(diǎn)樣儀（Linomat5，瑞士卡瑪公司）⑴待測樣溶液的制備。⑵標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取在60℃烘箱中干燥至恒重的靛藍(lán)、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)40％乙醇氯仿溶液制成0.1mg/mL對照液。⑶薄層色譜條件。參照《中國藥典》中描述的方法。⑷點(diǎn)樣、掃描與計(jì)算。精密吸取待測樣溶液5μL，標(biāo)準(zhǔn)品溶液2μL和7μL，用半自動點(diǎn)樣儀分別交叉點(diǎn)于同一硅膠薄層板上，展開后進(jìn)行雙波長反射法鋸齒掃描，測量待測樣品溶液吸收度積分值與標(biāo)準(zhǔn)品吸收度積分值，計(jì)算含量。⑸穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液5μL

點(diǎn)于硅膠薄層板上，展開，掃描測定，計(jì)算濃度。⑹精密度試驗(yàn)。薄層板上點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液7點(diǎn)，每點(diǎn)5μL，展開，掃描，計(jì)算濃度。⑺加標(biāo)回收率試驗(yàn)。加標(biāo)后進(jìn)行提取、加樣，薄層掃描法測定含量，求出加標(biāo)回收率。分別取靛藍(lán)、靛玉紅對照溶液，在200~700nm波長范圍內(nèi)掃描，靛藍(lán)在608nm處有最大吸收，靛玉紅在544nm處有最大吸收，且相互干擾較小，2種成分在700nm處幾乎無吸收。因此，確定λS=544和608nm分別為靛藍(lán)、靛玉紅的測定波長，λR=700nm為參比波長。

測定方法高效液相色譜法雙波長分光光度法薄層掃描法靛藍(lán)含量330.49390.28310.22靛玉紅含量363.33441.19359.65柱色譜是將吸附劑填充到一根玻璃管或金屬管中進(jìn)行的色譜技術(shù)。可以用來分離大多數(shù)有機(jī)化合物，尤其適合于分離復(fù)雜的天然產(chǎn)物和精制較大量的樣品。第三節(jié)柱色譜法的應(yīng)用層析過程是基于樣品組分在兩“相”溶劑之間的分配系數(shù)（分配層析）、吸附劑對組分的吸附能力（吸附層析）、離子交換的性質(zhì)（離子交換層析）、分子的大小（排阻層析）等差異而分離。大型色譜柱記錄器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptorreservoirA梯度制造器緩沖液膠體層析柱膠體填裝監(jiān)視器分步收集器層析系統(tǒng)的組成層析的操作步驟

裝置選擇上樣和洗脫結(jié)果檢測

上樣均一性洗脫裝置目的不同檢測方法不同活性檢測基質(zhì)均勻性柱層析的L/d比值設(shè)A、B兩組份中A的分配系數(shù)KA大于B的分配系數(shù)KB。分配系數(shù)小的B先被流動相帶出色譜柱進(jìn)入檢測器。檢測器將可測性質(zhì)轉(zhuǎn)化為電訊號，并通過記錄儀記錄下來形成B峰。分配系數(shù)大的A組份后流出色譜柱進(jìn)入檢測器，在記錄儀上形成A峰。分離原理AB有交叉一、分配柱色譜二、吸附柱色譜1．吸附劑的活度及其調(diào)節(jié)吸附劑的活性取決于含水量。吸附劑的活性一般分為五級（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ）。數(shù)字越大，表示活性越小，一般常用Ⅱ～Ⅲ。向吸附劑中添加水，可以降低其活性。反之，除去吸附劑中的部分水，則可增加活性。后者稱為吸附劑的活化。與吸附薄層有區(qū)別嗎？二、吸附柱色譜2、層析工藝過程確定吸附劑用量→選擇柱子→裝柱→測量柱留體積→加樣或拌樣→洗脫→分部收集→檢測→合并→濃縮氧化鋁：一般選擇中性、150~200目；

用量：1g樣品/20~50g，特例1g樣品/100~200g。硅膠：1g樣品/20~50g，特例1g樣品/500~1000g，用前120℃烘24h。柱色譜3、選擇色譜柱及裝柱：實(shí)驗(yàn)室用玻璃柱，工業(yè)用不銹鋼柱。要求：徑長比1:10~1:20，特例1:40；內(nèi)壁光滑均勻，上下粗細(xì)均勻；管壁無裂縫，活塞密封好；柱子大小由吸附劑用量確定;吸附劑為柱體積的3/4~4/5。內(nèi)壁不光滑易產(chǎn)生溝流柱色譜干裝柱法：在下端減壓抽氣的同時(shí)，將吸附劑通過長徑漏斗緩緩倒入。濕裝柱法：方法一：加入一定體積的溶劑，緩慢加入吸附劑（必要時(shí)可輕敲柱壁），排除多余溶劑，計(jì)算柱留體積；方法二：量取一定體積的溶劑倒入稱量好的吸附劑，間歇性攪拌數(shù)次，攪拌下裝柱，計(jì)算柱留體積。柱色譜4、加樣：方法一：將樣品溶于合適的溶劑，不擾動吸附劑層面，加到柱體上面，用少量溶劑洗滌柱壁2~3次；方法二：將樣品溶于合適的溶劑后，在攪拌下加入樣品量3~5倍的吸附劑，晾干至粉末狀，然后在不擾動吸附劑層面的情況下，加到柱體上面。要記得哦柱色譜5、洗脫：在洗脫的過程中，尤其是開始階段，不能擾動層面。洗脫速度一般為每分鐘流出1/200柱留體積左右，標(biāo)記分界管號。也可用溶劑存儲瓶(SCHLENK)，較貴。規(guī)格有：25ml、50ml、100ml、250ml和350ml。自己算算3cm×50cm的柱1min大約流出多少毫升？柱色譜分部收集：一般每管收集1/20~1/10柱留體積檢測：確定目標(biāo)物的位置及純化情況方法一：薄層色譜或紙色譜檢測；方法二：氣相色譜或液相色譜檢測；合并：成分相同或相似的收集液合并，交叉部分單獨(dú)收集。濃縮：旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)，確保燒瓶干燥干凈。柱色譜二、聚酰胺柱色譜聚酰胺（Polyamide）己發(fā)展成為用途廣泛的層析方法，如黃酮、酚類、醚類、有機(jī)酸、生物堿、萜類、甾體、苷類、糖類、氨基酸衍生物、核苷類等。尤其對黃酮類、酚類、醌類等的分離比其他方法優(yōu)越。

其特點(diǎn)是：分離效果高，可分離性質(zhì)極相近的類似物，柱層析的樣品容量大，適于制備。柱色譜前處理和裝柱：若用含水溶劑系統(tǒng)層析，常以水裝柱。聚酰胺粉以90%~95%乙醇浸泡（除去蠟質(zhì)），攪拌除去氣泡后裝柱。聚酰胺的處理：用3~4BV的90%~95％乙醇洗滌至洗液透明，蒸干后無殘?jiān)来斡?~2.5BV的5%NaOH除去單體和聚酰胺低聚物、1BV的蒸餾水、2~2.5BV的l0％醋酸水溶液洗滌，最后用蒸餾水洗至中性，備用。絕對不能搞反了柱色譜前處理和裝柱：以非極性溶劑層析時(shí)，常以溶劑組份中極性低的組份裝柱：若以氯仿裝柱，因其比重較大使聚酰胺粉浮在上面，加樣時(shí)應(yīng)將柱底端的氯仿層放出，立即加樣后頂端以棉花塞緊。關(guān)閉層析時(shí)應(yīng)將頂端的多余氯仿液放出，否則，聚酰胺會浮起而攪亂層帶。還得記住柱色譜加樣：樣品常用洗脫劑溶解，濃度在20%~30%。拌入干粉中，拌勻后將溶劑減壓蒸去，以洗脫劑浸泡裝入柱中。一般每l00ml聚酰胺粉可上樣1.5~2.5克。特例：若利用聚酰胺除去鞣質(zhì)，樣品上樣量可大大增加。通常觀察其在柱上形成橙紅色色帶的移動，當(dāng)樣品加至該色帶移至柱的近底端時(shí)，停止加樣。柱色譜洗脫：洗脫劑常采用由稀至濃的乙醇液（10%、30%、50％、70％、95%），或氯仿→氯仿-甲醇（19+1，l0+1，5+1，2+1，1+1）→甲醇依次洗脫。若仍有物質(zhì)末洗脫下來，可采用3.5%氨水洗脫。更換洗脫劑一般在洗脫液顏色變?yōu)楹艿瓡r(shí)進(jìn)行。收集與檢測：同上。柱色譜聚酰胺粉的再生：一般用5%NaOH洗滌，洗至顏色極淡為止。有時(shí)因某些鞣質(zhì)與聚酰胺有不可逆吸附，用氫氧化鈉很難洗脫時(shí)，可用5%NaOH液在柱中浸泡。每天將柱中氫氧化鈉液放出一次，并加入新的氫氧化鈉液浸泡，這樣浸泡洗滌一周后，鞣質(zhì)可基本洗完。然后用