PCR的基本原理和應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPolymeraseChainReaction）

一種人工在體外進(jìn)行快速DNA片斷擴(kuò)增的方法。分子生物學(xué)技術(shù)1PCR技術(shù)基本原理

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。分子生物學(xué)技術(shù)1分子生物學(xué)技術(shù)1分子生物學(xué)技術(shù)1RAPDSSRRFIPRT-PCRNested-PCRPCRmutagenesis(誘變)RaceGenomicwalking分子生物學(xué)技術(shù)1Reversetranscriptase(RT)-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCR分子生物學(xué)技術(shù)1NestedPCRFirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest分子生物學(xué)技術(shù)1SP6primerT7primerForwardmutagenicprimerReversemutagenicprimerFirstPCRRemoveprimersDenatureandannealExtendtofulllengthbyDNApolymerase3’3’PCRmutagenesis(誘變)分子生物學(xué)技術(shù)1SecondPCRSP6primerT7primerDNAcloning分子生物學(xué)技術(shù)1克隆(clone)

一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖的方式產(chǎn)生一群細(xì)胞或一群個(gè)體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無(wú)性繁殖(細(xì)胞)系。其動(dòng)詞含義指，即技術(shù)。

分子克隆(clone,cloned,cloning)

在生物體外用重組技術(shù)將特定基因插入載體分子中.將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價(jià)連接，然后引入寄主細(xì)胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。

分子克隆分子生物學(xué)技術(shù)1Cloningvectors(克隆載體):在基因工程重組DNA技術(shù)中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的DNA分子。

E.colicloningvector(circular): plasmids(質(zhì)粒) bacteriophages(landM13)(噬菌體) plasmid-bacteriophagelhybrids(cosmids) (考斯質(zhì)粒,質(zhì)粒和噬菌體雜和體).Yeastcloningvector:yeastartificial chromosomes(YACs，酵母人工染色體) (Linear)分子生物學(xué)技術(shù)1分子生物學(xué)技術(shù)1限制性內(nèi)切酶連接酶分子生物學(xué)技術(shù)1用相同的限制性內(nèi)切酶對(duì)插入片段和載體同時(shí)酶切。用連接酶將插入和載體連接。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中。在有抗生素的培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。分子生物學(xué)技術(shù)1Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantplasmid:containinginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantplasmid(containinsert)分子生物學(xué)技術(shù)1克隆載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增，表達(dá)載體不僅使外源基因擴(kuò)增，還要使其表達(dá)。分子生物學(xué)技術(shù)1凝膠阻滯電泳(ElectrophoreticmobiliyshiftassayEMSA)EMSA是體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)?；驹淼鞍踪|(zhì)與DNA結(jié)合后將大大增加分子量，在凝膠電泳中，DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其相對(duì)分子量的隊(duì)數(shù)成正比。沒有結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA移動(dòng)較快，結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA由于受到阻滯移動(dòng)較慢。用放射性同位素標(biāo)記待測(cè)DNA片段，然后與提取物溫育，形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳后用放射性自顯影技術(shù)可以確定DNA條帶的位置，從而確定它與蛋白質(zhì)是否結(jié)合。分子生物學(xué)技術(shù)1DNAboundtotwoproteinsDNA-proteincomplexBareDNAADNAboundwithmorethanoneproteintoformalargercomplex.分子生物學(xué)技術(shù)1DNaseIfootprinting(DNaseI足跡法)確認(rèn)和蛋白質(zhì)互作的DNA序列。AATAAG5’*Sequenceladderisrequiredtodeterminethepreciseposition分子生物學(xué)技術(shù)1BindproteinDNase(mild),thenremoveproteinanddenatureDNADNasefootprinting

和蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA不被DNase降解.

電泳，放射性自顯影分子生物學(xué)技術(shù)1015[Protein]ThethreelanesrepresentDNAthatwasboundto0,1,and5unitsofprotein.

Thelanewithnoprotein

showsaregularladderoffragments.Thelanewithoneunitshowssome

protection,andthelane

with5unitsshowscompleteprotectioninthemiddle.

Byincludingsequencingladders,wecantellexactlywheretheproteinbound.TCGGAGCAACGCAAACAAACGTGCTTGG分子生物學(xué)技術(shù)1酵母雙雜交yeasttwo-hybridsystem很多真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子有兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain,BD）和轉(zhuǎn)錄激活域

(activationdomain,AD)BD能和特定的基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，但不能接獲基因的轉(zhuǎn)錄。AD可以在適當(dāng)?shù)目臻g激活轉(zhuǎn)錄分子生物學(xué)技術(shù)1酵母雙雜交的原理

運(yùn)用基因重組技術(shù)將已知蛋白的DNA序列連接到帶有酵母轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)的表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化酵母后能夠形成融合蛋白（誘餌蛋白）。將已知編碼轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）的DNA分別與待篩選的cDNA文庫(kù)中的不同插入片段相連接，在酵母中表達(dá)形成融合蛋白（獵物蛋白）。如果誘餌蛋白和獵物蛋白能夠相互作用，AD和BD結(jié)構(gòu)域會(huì)被拉近，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)。這是一種研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。分子生物學(xué)技術(shù)1酵母雙雜交yeasttwo-hybridsystem分子生物學(xué)技術(shù)1酵母單雜交系統(tǒng)順式作用元件基本啟動(dòng)子報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄因子AD運(yùn)用基因重組技術(shù)將特定順式作用元件構(gòu)建到基本啟動(dòng)子上游，把報(bào)告基因連接到基本啟動(dòng)子下游。將待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母激活域（AD）的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母，如果待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子能和順式作用元件結(jié)合，就能激活基本啟動(dòng)子，從而激活報(bào)告基因的表達(dá)。這是一種研究DNA和蛋白質(zhì)互相作用的系統(tǒng)。分子生物學(xué)技術(shù)11.GelelectrophoresisseparatesDNAandRNAmoleculesaccordingtosize,shapeandtopologicalpropertiesGelElectrophoresis（凝膠電泳）分子生物學(xué)技術(shù)11.DNAandRNAmoleculesarenegativelycharged,thusmoveinthegelmatrix(膠支持物)towardthepositivepole(正電極).2.LinearDNAmoleculesareseparatedaccordingtosizes.ThelargeDNAmoleculesmoveslowerthanthesmallmolecules.3.ThemobilityofcircularDNAmoleculesisaffectedbytheirtopologicalstructures.ThemobilityofthesamemolecularweightDNAmoleculewithdifferentshapesis:supercoiled(超螺旋)>linear(線性)>nickedorrelaxed(缺刻或松散)

DNAgelmobility(DNA在膠上的遷移性)分子生物學(xué)技術(shù)1Agarose(瓊脂糖):amuchlessresolvingpowerthanpolyacrylamide,butcanseparateDNAmoleculesofuptotensofkb1kb0.5kb2kb3kb4kb分子生物學(xué)技術(shù)1Polyacrylamide

(聚丙稀酰胺):hashighresolvingcapability,andcanresolveDNA/RNAthatdifferfromeachotheraslittleasasinglebasepair/nucleotide.分子生物學(xué)技術(shù)1分子雜交分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交,經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。

分子生物學(xué)技術(shù)1類型核酸探針應(yīng)用SouthernDNADNAorRNA基因拷貝數(shù)等NorthernRNADNAorRNARNA大小和表達(dá)豐度WesternProtein抗體蛋白的大小和豐度ComparisonofSouthern,NorthernandWesternbolthybridization分子生物學(xué)技術(shù)1SouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblotGenomicDNApreparation RNApreparationRestrictiondigestion -Denaturewithalkali -Agarosegelelectrophoresis

DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling

6.Hybridization (temperature)

7.Signaldetection(X-ra