免疫組化在病理診斷中的正確應(yīng)用周曉軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院引言

免疫組化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理診斷：

在解決疑難病例診斷方面起著重要作用；

隨著人們醫(yī)療風(fēng)險意識的增強(qiáng)，許多普通的病

例也常常需要免疫組化進(jìn)一步證實(shí)；

成為病理醫(yī)生常規(guī)工作不可缺少的重要工作；

常規(guī)手段；引言

免疫組化技術(shù)廣泛應(yīng)用于病理診斷工

作得益于免疫組化技術(shù)的進(jìn)步：

抗原修復(fù)技術(shù)；

更加敏感的檢測系統(tǒng)或放大系統(tǒng)的建立；

更多可用于常規(guī)標(biāo)本的抗體的出現(xiàn)；

快捷地抗體流通及良好的售后服務(wù)。引言腫瘤病理診斷：

經(jīng)驗、權(quán)威＝主觀性

強(qiáng)

HE形態(tài)

+

特染，電鏡

HE形態(tài)

+

免疫組化

+

分子病理？免疫組化：

HE形態(tài)（標(biāo)準(zhǔn)模糊）：

新的診斷標(biāo)準(zhǔn)！

更客觀！更權(quán)威！

腫瘤分類有了本質(zhì)的區(qū)別

有了客觀標(biāo)準(zhǔn)作為對照，

再不僅僅靠積累經(jīng)驗,

專家

大大縮短學(xué)習(xí)周期

年青人有了更多的機(jī)會！引言Experience

based?

Experience--Evidence

based!The

days

of

saying

“It

is

what

it

is

because

I

sayit

is”

are

gone!病理診斷進(jìn)入新時代！當(dāng)代合格的病理醫(yī)生

臨床知識

HE形態(tài)知識

免疫組化知識

分子病理知識引言

目前國內(nèi)免疫組化在病理診斷應(yīng)用中

存在的問題亟待解決:

技術(shù)操作不規(guī)范，缺

不充分了解應(yīng)用范圍

知識更新太快：每年12000篇新的文獻(xiàn)

（2005年,

人體病理），知識老化！

簡單化！抗體選擇及結(jié)果判斷失誤

過分或單純依賴免疫組化！忽視臨床、

HE結(jié)合！帶來新的誤診！

一、免疫組化的應(yīng)用范圍腫瘤的病理診斷：

幫助良惡性病變鑒別未分化惡性腫瘤（癌或肉瘤）性質(zhì)的判斷各種圓細(xì)胞、梭形細(xì)胞、多形性腫瘤的鑒別診斷幫助確定轉(zhuǎn)移性腫瘤的原發(fā)部位等個體化治療分子靶點(diǎn)檢測:

CerbB-2、CD20、CD117……CKAE3男，57歲，左上肺腫塊TTF1TGCK20

CK7肺結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移透明細(xì)胞癌的免疫組化鑒別腎透明細(xì)胞癌肝透明細(xì)胞癌腎上腺腺瘤卵巢透明細(xì)胞癌HEPPAR1CD1034βE-12InhabinMelan-AEMApCEACK19CK7CK8/CK18

-

+

--/+

-

+

-+/-

-

+++---++--+---++-----

-

-

+

-

-

++/-

+

+

+

一、免疫組化的應(yīng)用范圍淋巴造血系統(tǒng)疾病的診斷：

鑒別反應(yīng)性增生性疾病與淋巴瘤；各類淋巴瘤分型的重

要依據(jù)。在淋巴造血疾病的病理診斷中免疫組化目前已成為常規(guī)開展的工作項目。Bcl-2Bcl-2一、免疫組化的應(yīng)用范圍內(nèi)分泌腫瘤的診斷：不僅可以幫助確定診斷，還可以通過檢測腫瘤分泌激素達(dá)到功能分類的目的。在軟組織腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等其他各系統(tǒng)腫瘤的病理診斷中免疫組化也具有重要的作用。一、免疫組化的應(yīng)用范圍小活檢病理檢查：能明確地顯示癌細(xì)胞的存在（如胃粘膜活檢中的印戒細(xì)胞癌）；腫瘤穿刺活檢時腫瘤類型的確定。微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)及骨髓）、甚至不易察覺的病變得以確診。CgAEMAM,

54,

胃大彎潰瘍

CD3，CD20，CD68均散在細(xì)胞陽性，數(shù)量不等活檢類癌手術(shù)

SCC類癌活檢手術(shù)CK類癌CgA類癌SCCSCCSCC

SCC

TTF-1

類癌Ki－67

類癌活檢標(biāo)本類癌和小細(xì)胞癌的相對鑒別

特點(diǎn)腫瘤部位核染色質(zhì)血管核分裂像CgA,

SynKi-67

類癌

中央或周圍顆粒狀，有時粗糙

薄壁

≤10/10HPF

陽性強(qiáng)

低（典型的＜20%）

小細(xì)胞癌

中央多見

細(xì)致、均勻

厚壁、腎小球樣

＞

10/10HPF

陽性弱高（典型的＞50%）From

AJSP

2005,

29(2):179-187一、免疫組化的應(yīng)用范圍細(xì)針穿刺、細(xì)胞學(xué)診斷主要是定性診斷？免疫組化的應(yīng)用有可能對部分腫瘤進(jìn)一步地進(jìn)行分類或明確來源。LCA一、免疫組化的應(yīng)用范圍乳腺癌激素受體（ER、PR）的檢測在指導(dǎo)臨床治療方面已起到了重要的作用。針對腫瘤基因產(chǎn)物（C-erbB2,

P53,

ALK，CD117等）的抗體為基因治療提供重要的參考依據(jù)。細(xì)胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫組化染色可為腫瘤的預(yù)后提供依據(jù)。已用于臨床的新型靶向治療藥物美羅華：CD20單克隆抗體，用于治療CD20+的B細(xì)胞淋巴瘤Herceptin：c-erbB-2（neu）單克隆抗體，用于治療c-erbB-2過度表達(dá)的乳腺癌STI-571（Gleevec，imatinib）：小分子選擇性蛋白酪氨酸激酶抑制劑，用于CML和GIST治療一、免疫組化的應(yīng)用范圍某些感染性疾病的病因診斷，如HBV、HCV、EBV、CMV等病毒的檢測。但與分子生物學(xué)等技術(shù)相比，免疫組化檢測病原微生物敏感性常常較差，因此應(yīng)用范圍有限。HPVHBsAg二、免疫組化的局限性對于許多非腫瘤性疾病由于常常無特異的抗原表達(dá)，因此其診斷仍依據(jù)于特異的常規(guī)光鏡及電鏡形態(tài)表現(xiàn)，如腎小球腎炎的診斷，多種感染性疾病、各種代謝性疾病，細(xì)胞內(nèi)/外異常物質(zhì)沉積性疾?。ㄈ绲矸蹣幼冃裕?，肌活檢診斷等；HIV冠狀病毒分枝桿菌組織胞漿菌二、免疫組化的局限性至今無絕對特異的抗體！相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異的抗原表達(dá)；同一種抗原常?？稍诙喾N腫瘤中表達(dá)，不少腫瘤又由于分化太差或細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)改變而不表達(dá)相關(guān)的抗原。二、免疫組化的局限性不同抗體滴度有不同的陽性結(jié)果：

HBME-1

1:100

(推薦濃度)間皮膜陽性，幾乎所有腺癌胞漿陽性

1:2000~15000

僅僅間皮膜陽性內(nèi)源性生物素：假陽性（胞漿），如肝細(xì)胞及肝細(xì)胞癌不同克隆ER表達(dá)差異SP16F11二、免疫組化的局限性免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化（同一實(shí)驗室及不同實(shí)驗室間結(jié)果的一致性）、定量結(jié)果的判斷等還存在不少的問題尚待解決。

三、如何正確應(yīng)用免疫組化正確、有價值的免疫組化結(jié)果：

免疫組化實(shí)驗室規(guī)范、合適的技術(shù)操作（包

括組織固定、抗原修復(fù)、檢測系統(tǒng)、各類試

劑的質(zhì)量保證，染色技術(shù)等）是最重要的基

礎(chǔ)保證；

但病理醫(yī)生在組織塊的選擇，抗體的選擇，

結(jié)果的判斷等方面也起著不容忽視的作用。三、如何正確應(yīng)用免疫組化1、組織塊的選擇首選有典型病變、分化較好、固定較好的組織塊。應(yīng)盡量選擇有正常組織（有內(nèi)對照組織）的蠟塊。對固定時間較長或未及時固定的組織，凍融后的組織或脫鈣后的組織應(yīng)盡可能地避免使用。

2.

抗體的選擇經(jīng)驗性、知識性要求很高的一項藝術(shù)工作。選擇到－組織合適的抗體—費(fèi)用最小而又能完全達(dá)到目的。病理醫(yī)生須通過認(rèn)真觀察HE切片并聯(lián)系臨床相關(guān)信息，準(zhǔn)確地列出要鑒別的幾種可能性診斷。

病理醫(yī)生對HE形態(tài)要熟練掌握，知識面廣，既不能撒大網(wǎng)似的羅列出太多的診斷，使費(fèi)用增加過多；也不能遣漏可能的診斷，造成誤診或再選擇抗體延遲報告時間。大細(xì)胞未分化癌？CK，EMA……惡黑？S100，HMB45……

淋巴瘤？CD20，CD3……CK+,EMA+,S100-,

HMB45-CD20-,CD3-,診斷：大細(xì)胞未分化癌ALCL？CD30，ALK1……CD30

2.

抗體的選擇另一方面病理醫(yī)生要對各種抗體的免疫反應(yīng)譜及交叉反應(yīng)（更重要?。。┒际质煜ぃ?/p>

如CK不僅表達(dá)于上皮還可表達(dá)于肌纖維母細(xì)胞，

平滑肌細(xì)胞，間皮下細(xì)胞……等。并熟知各種腫瘤的免疫表型（包括異常的免疫組化表達(dá)!）。CKCD31

2.

抗體的選擇如何了解各種抗體的免疫反應(yīng)譜及各種腫瘤的免疫表型？

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2.

抗體的選擇至今無絕對特異的抗體！無100%病例或腫瘤細(xì)胞陽性的抗體！選擇一組抗體而不是一個抗體“交叉陽性”的原則：如癌與惡性黑色素瘤鑒別：

選一個或二個低分化癌表達(dá)陽性而惡黑陰性的抗體，如CK、EMA，同時還要選一個或二個惡黑表達(dá)陽性而癌表達(dá)陰性的抗體，如S－100，Melan-A。若染色結(jié)果與預(yù)期結(jié)果矛盾則應(yīng)考慮其他的診斷或核查免疫組化染色是否有問題。

2.

抗體的選擇抗體選擇不僅要選準(zhǔn)，還要選足。

一個可能的診斷要選2個或多個抗體，以防腫瘤異常免疫表達(dá)造成誤診。如淋巴瘤分類診斷時，一組抗體中至少要包括2個以上的T細(xì)胞及B細(xì)胞標(biāo)志（CD3、CD43、CD20、CD79a/Pax-5等）。CD43

2.

抗體的選擇先采用一線抗體，先確定一定的范圍，再應(yīng)用二線抗體進(jìn)一步明確診斷？

可能由于一線抗體選擇太少，部分腫瘤有交叉反應(yīng)而導(dǎo)致開始就犯導(dǎo)向性的錯誤，最終導(dǎo)致誤診。EMAKappa

輕鏈Pre-pre

BcellPre-BcellImmature

MatureB

cell

B

cellActivatedB

cellPlasmacellVirgin

B

cells;antigenindependentGerminal

center

&

post-GC

cells;

antigendependent

Precursor

cells;

antigen

independent

TdTCD79a

CD19

CD20,

CD22

Cytoplasmic

CD22

CD10

Bcl-6

CD138

2.

抗體的選擇選擇同一類抗體時還要考慮到各種抗體的敏感性及特異性。

首選當(dāng)然要選敏感性及特異性都好的抗體，但有些特異性雖然不高但有很高敏感性的抗體在不少情況下可能發(fā)揮更重要的作用。如S－100。不同公司生產(chǎn)的同一類抗體可能敏感性及特異性有所不同，或要求的抗原修復(fù)方法等技術(shù)條件不同，應(yīng)根據(jù)本實(shí)驗室預(yù)試驗結(jié)果進(jìn)行選擇。

3.

結(jié)果的判斷免疫組化染色最終是否能得到正確的結(jié)論，關(guān)鍵還要看對染色結(jié)果如何評價（解釋）。同一種染色結(jié)果可有不同的病理診斷。應(yīng)該首先核查一下染色反應(yīng)是否成功（這也是免疫組化室內(nèi)質(zhì)控的一個重要步驟）。

評價染色反應(yīng)是否成功最好比較同一張切片中存在的正常組織，即所謂的內(nèi)陽性對照。CKpanCD20SMA?CK-7!SMACD3CD203.

結(jié)果的判斷有不少染色或病例缺乏內(nèi)陽性對照，若對染色反應(yīng)有疑問只能選用另外的陽性對照片核實(shí)。若內(nèi)（或外）陽性對照組織免疫反應(yīng)陰性，瘤組織陽性則表明假陽性；瘤組織陰性則表明假陰性。只有陽性對照染色陽性瘤組織反應(yīng)才屬真實(shí)。3.結(jié)果的判斷除了內(nèi)陽性對照，還要看內(nèi)陰性對照是否有非特異反應(yīng)。內(nèi)源性生物素造成的非特異染色（如在肝、腎及富含線粒體的細(xì)胞等），常常表現(xiàn)為非特異的胞漿陽性。總之，只有陽性對照染色陽性，陰性對照組織又基本陰性，這樣的免疫組化染色結(jié)果才可信。desmindesminSMA

3.

結(jié)果的判斷其次，要分析陽性染色的部位（細(xì)胞的微解剖部位）是否正確:

如許多淋巴細(xì)胞的標(biāo)志（CD20，CD43，CD5，CD45RB，CD30，C-erbB2等）應(yīng)為膜陽性，若胞漿彌漫陽性間或細(xì)胞核陽性則為假陽性。反之，有的抗體染色應(yīng)為核陽性（如ER，PR，TdT，Cyclin

D1等），若胞漿或胞膜陽性也為假陽性。還有的抗體可表現(xiàn)為二種陽性反應(yīng)類型，如S－100，ALK可為核陽性也可伴有胞漿陽性；CD30，CD15即可表現(xiàn)為細(xì)胞膜陽性，也可表現(xiàn)為核旁高爾基區(qū)陽性。C-erbB-2E-cadherinCD20CD30PRERTDTTTF-1P

53Ki-67Me

l-AMel-panALK-1ALK-1ALK-1ALK-1CD30CD15CEACEAC-Kit/CD117

3.

結(jié)果的判斷隨著對免疫反應(yīng)靶分子部位的更深入了解，免疫反應(yīng)的形態(tài)也是重要的參考依據(jù)，

如嗜鉻蛋白A，細(xì)胞毒標(biāo)志（粒酶B，穿孔素，TIA－1）等陽性反應(yīng)在胞漿內(nèi)應(yīng)呈顆粒狀，而CD79a等為胞漿彌漫陽性，細(xì)胞角蛋白染色陽性應(yīng)為胞漿細(xì)絲狀，若反應(yīng)類型不符可能也要懷疑為假陽性。但要精確觀察到陽性反應(yīng)的細(xì)微類型表現(xiàn)必須切片薄，并采用高分辨率的顯色系統(tǒng)。CD35granzyme

B

3.

結(jié)果的判斷再者，確定免疫反應(yīng)陽性的組織或細(xì)胞是否為腫瘤或有意義的組織/細(xì)胞。若腫瘤成份較少，彌散存在，可能會將周圍反應(yīng)性成份或殘余組織的陽性反應(yīng)誤認(rèn)為腫瘤陽性，導(dǎo)致錯誤的診斷。

如伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤的未分化癌（鼻咽未分化癌），富于T細(xì)胞的大B細(xì)胞淋巴瘤，瘤組織中殘余的橫紋肌，脂肪組織等。還有的細(xì)胞（如肥大細(xì)胞）可對多種抗體表達(dá)陽性反應(yīng)，應(yīng)注意區(qū)別。Poorlymacrophagesalveolar

Napsin

Amacrophages

alveolar

alveolarSMA

3.

結(jié)果的判斷免疫組化染色陽性結(jié)果較陰性結(jié)果更有意義，

陰性結(jié)果：可能抗原的確不存在，或抗原含量低，組織處理時抗原丟失，染色方法不敏感或操作有誤。3.

結(jié)果的判斷應(yīng)用于鑒別診斷或證實(shí)診斷的免疫組化染色多為定性觀察，定量沒有太大的意義。但用于預(yù)后，增殖指數(shù)、激素受體等檢測的免疫組化染色不僅要做定性觀察，還應(yīng)該做定量的評價才對臨床有價值。CK滑膜肉瘤

3.

結(jié)果的判斷遺憾的是目前由于實(shí)驗室間未實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，因此定量的標(biāo)準(zhǔn)（域值）尚無統(tǒng)一的認(rèn)識，

如ER受體，有的實(shí)驗室只要有陽性腫瘤細(xì)胞就視為陽性，而有的實(shí)驗室要至少20％細(xì)胞陽性才視為陽性，陽性標(biāo)準(zhǔn)往往是隨意確定的，未經(jīng)臨床病理研究證實(shí)。3.

結(jié)果的判斷單單免疫組化染色結(jié)果無任何診斷價值！免疫組化診斷時結(jié)合HE形態(tài)十分重要：抗體的選擇及結(jié)果的判斷都要以HE形態(tài)為依據(jù)。免疫組化診斷的一個重要原則！當(dāng)免疫組化最后結(jié)果出乎意料之外，與HE預(yù)期結(jié)果差別很大時首先要核查免疫組化染色中存在的問題；若確實(shí)免疫組化染色無誤，要進(jìn)一步核實(shí)（查閱文獻(xiàn)/上網(wǎng),

專家，產(chǎn)品目錄？）是否有不了解的交叉反應(yīng)或異常表達(dá)!

3.

結(jié)果的判斷如果免疫組化染色結(jié)果確定可信，則不能不考慮另外的診斷，但要結(jié)合臨床、影像學(xué)等檢查結(jié)果綜合分析后才能否定原來的HE診斷。出現(xiàn)這樣的情況可能是新文獻(xiàn)了解不全面，對某些腫瘤特殊的HE形態(tài)表現(xiàn)尚未了解，或的確有新的特殊的形態(tài)表現(xiàn)

如印戒細(xì)胞型濾泡淋巴瘤，小細(xì)胞型的大細(xì)胞間變型淋巴瘤，上皮樣硬化性纖維肉瘤，肝臟血管平滑肌脂肪瘤，酷似少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤的中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤，脊索瘤樣腦膜瘤等。

免疫組化在病理診斷中的正確應(yīng)用觀念要時時更新！

及時更新抗體（組織細(xì)胞標(biāo)記，myoglobin，vimentin，等）新應(yīng)用抗體（p63，calponin，B-Catenin,TTF-1,

TFE3,Clusterin,et

al)新反應(yīng)（CD10,

CD34,CD99，et

al)新pattern免疫組化在病理診斷中的正確應(yīng)用抗體的新反應(yīng)：

CD10：粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、部分腺癌、胰

腺實(shí)性-假乳頭性腫瘤、肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、

子宮間質(zhì)肉瘤……

CD34：造血干細(xì)胞、血管、皮隆突、SFT、

GIST、部分脂肪腫瘤、上皮樣肉瘤……

CD99：PNET、滑膜肉瘤、SFT、間葉性軟

骨肉瘤、小細(xì)胞性骨肉瘤、胸腺瘤、NE癌、

淋巴母細(xì)胞性淋巴瘤、少數(shù)橫紋肌肉瘤……

抗體的新反應(yīng)：TTF1

甲狀腺腫瘤：濾泡癌、乳頭狀癌、髓樣癌肺腫瘤：腺癌、硬化性血管瘤、小細(xì)胞癌（50－100

％）、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（約30％）、鱗癌（4％）TTF1

（陽性率低）

CNS腫瘤：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、室管膜瘤、垂體細(xì)胞瘤等肺外小細(xì)胞癌、NEM、腺癌等胞漿特異表達(dá)于肝細(xì)胞癌CK