ICS11.220DB22B41吉林省地方標準DB22/T2921—2018禽白血病A/B/J亞群檢測PCR法DetectionmethodofPCRofavianleukosisA,BandJ-subgroups吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布DB22/T2921—2018前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。本標準由吉林省畜牧業(yè)管理局提出并歸口。本標準起草單位：吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院。本標準主要起草人：曹利利、郭衍冰、董航、姚新華、苑淑賢、程榮華、邵洪澤。IDB22/T2921—2018禽白血病A/B/J亞群檢測PCR法1范圍本標準規(guī)定了禽白血病A/B/J亞群PCR檢測方法的技術(shù)要求。本標準適用于禽白血病A/B/J亞群的核酸檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3試劑或材料3.1試劑3.1.1病毒基因組DNA提取試劑盒。3.1.2陽性對照，為禽白血病病毒基因組DNA，或含有上述片段的質(zhì)粒標準分子DNA。3.1.3陰性對照，健康雞血液或血清DNA。3.1.62U/μLTaqDNA聚合酶。3.1.11上樣緩沖液，見附錄A.5。3.2.110μL、200μL和1000μL吸頭。3.2.21.5mL離心管。引物序列、濃度及擴增長度見表1。1DB22/T2921—2018表1引物序列及濃度引物序列引物使用濃度擴增長度上游引物F5′-GCCAAACGGATTTCTGCCTT-3′5′-AACCCAGATACCAAGGAACC-3′5′-ACAGATGGACCAATTCTGTCTC-3′5′-ATTGTTCCACAACACCTCTG-3′ARBRJR375bp581bp683bp10μmol/L下游引物4儀器設(shè)備4.1微量移液器，2.5μL、20μL、200μL、1000μL。4.2電子天平，感量0.1mg。4.3均質(zhì)器。4.4低溫高速離心機。4.5PCR擴增儀。4.6核酸電泳儀。用移液器（4.1）吸取抗凝血液或血清樣品500μL（3.2.1）于1.5mL的離心管（3.2.2）中，以病毒基因組DNA提取試劑盒（3.1.1）提取樣本DNA，操作方法按說明書進行。用移液器吸取雞胚尿囊液500μL于1.5mL的離心管中，以病毒基因組DNA提取試劑盒提取樣本稱?。?.2）100mg肝臟、脾臟或胰腺等組織用均質(zhì)器（4.3）研碎，以病毒基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA，操作方法按說明書進行。將喉拭子和/或泄殖腔拭子（3.2.3）置于1.5mL離心管中，以少量ddH2O浸潤，用離心機（4.4）3000r/min離心15min，取上清液500μL于1.5mL離心管中，以病毒基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA，操作方法按說明書進行。2DB22/T2921—20186試驗步驟6.1PCR擴增分別設(shè)立以ddH2O為模板的空白對照、陽性對照（3.1.2）、陰性對照（3.1.3）和待檢樣品，采用50μL反應(yīng)體系，在0.2mL薄壁PCR管（3.2.4）中依次加入表2所示的試劑后，瞬時離心混勻，做好標記，于PCR儀（4.5）中擴增。表2PCR反應(yīng)體系成分用量10×PCR緩沖液（3.1.4）dNTPs（3.1.5）TaqDNA聚合酶（3.1.6）引物F（3.3）5μL4μL1μL4μL2μL2μL2μL4μL26μL引物AR（3.3）引物BR（3.3）引物JR（3.3）模板（5）ddH2O（3.1.7）PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。6.2.1將適量50×TAE（3.1.8）稀釋成1×TAE溶液，配制溴化乙錠（3.1.9）含量為0.5μg/mL的1.0%瓊脂糖凝膠（3.1.10），見附錄A.4。6.2.2取8μLPCR產(chǎn)物，與2μL上樣緩沖液（3.1.11）混勻，加入瓊脂糖凝膠板的加樣孔中。6.2.3加入標準分子量DL2000Marker（3.1.12）。7.1當ALV-A、ALV-B及ALV-J陽性對照分別出現(xiàn)375bp、581bp及683bp擴增帶，而空白對照和陰性對照未出現(xiàn)目的帶時，實驗結(jié)果成立。7.2當被檢樣品出現(xiàn)375bp、581bp或683bp擴增帶，則分別判定為ALV-A、ALV-B或ALV-J亞群陽性，參見附錄B，未出現(xiàn)相應(yīng)擴增帶的樣品判為陰性。3DB22/T2921—2018AA附錄A（資料性附錄）相關(guān)試劑配制A.110×PCR緩沖液10×PCR緩沖液配制見表A.1。表A.11mol/LTris-HCl（pH8.8）1mol/LKC110.0mL50.0mL8.0mL1.0mLNonidetP401.5mol/LMgCl2ddH2O加至1000.0mLA.250×TAE電泳緩沖液制備A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液配制（pH8.0）見表A.2。氫氧化鈉（1mol/LNaOH）ddH2O調(diào)pH至8.0加至100.0mLA.2.250×TAE電泳緩沖液配制見表A.3。溴化乙錠（EB）溶液見表A.4。4DB22/T2921—2018表A.4溴化乙錠ddH2O0.2g加至20.0mLA.41.0%瓊脂糖凝膠板制備1.0%瓊脂糖凝膠板制備見表A.5。表A.5瓊脂糖1.0g50×TAE電泳緩沖液ddH2O2.0mL98.0mL微波爐中完全融化，待冷卻至50℃60℃時，加溴化乙錠（EB）溶液5μL后搖勻，倒入電泳板中，凝固后取下梳子，備用。A.5上樣緩沖液上樣緩沖液見表A.6。表A.65DB22/T2921—20