TheTechniquesandApplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy----影響共聚焦掃描中圖像質(zhì)量的設(shè)備因素和制樣因素1書面實(shí)驗(yàn)報(bào)告：1如何判斷共聚焦圖片的熒光質(zhì)量？2影響共聚焦圖像質(zhì)量的硬件因素有哪些？請同學(xué)們撰寫好實(shí)驗(yàn)報(bào)告后，下次實(shí)習(xí)前由各班班長收齊并交給中心負(fù)責(zé)教學(xué)的王老師處！2一.概述二.影響共聚焦檢測質(zhì)量的主要設(shè)備參數(shù)三.因樣本的處理不當(dāng)影響共聚焦檢測質(zhì)量的因素四.樣本制作過程需要注意的問題3光電倍增管檢測針孔光源針孔光源分色鏡物鏡樣本聚集平面4評判熒光樣品制備是否有成功，可從以下幾個方面考量：1．熒光標(biāo)記反響的特異性和熒光信號定位準(zhǔn)確性2．保持樣品的結(jié)構(gòu)形態(tài)的完整性和免疫活性3．熒光信號的響應(yīng)準(zhǔn)確、靈敏、具有可重復(fù)性4．熒光強(qiáng)度5．熒光穩(wěn)定性6．熒光信號的分布的一致性7．兩種及兩種以上熒光信號之間熒光光譜交叉，即串色性8．背景噪聲干擾性5一.概述二.影響共聚焦檢測質(zhì)量的主要設(shè)備參數(shù)三.樣本的處理及影響共聚焦檢測質(zhì)量的因素四.樣本制作過程需要注意的問題6影響獲取圖像質(zhì)量主要的共聚焦參數(shù)：〔1〕檢測針孔〔DetectorPinhole〕〔2〕激光功率(Power)〔3〕聲光控制器〔AOTF--AcoustoOpticTunableFilter)〔4〕光電倍增管增益及靜噪控制〔PMTGain&PMTOffset〕〔5〕重復(fù)掃描-數(shù)字減噪〔Li.A.、Aver.〕〔6〕掃描圖分辨率〔Format〕:除此以外物鏡〔Objective〕、掃描速度〔ScanSpeed〕掃描方向〔UnidirectionalScan/BidirectionalScan〕(X-Direction)數(shù)碼放大〔ZoomIn〕……………7Pinhole檢測針孔：默認(rèn)值=1，數(shù)值<1解像度較好，數(shù)值>1訊燥比較好Pin=0.2Pin=1Pin=28光電倍增管PMTPMTgain/PMTffset9體會值：480~500<Gain<680~760-8~-0<Offest<+0~+202550255025510用線平均法進(jìn)行線掃描用線平均法進(jìn)行線掃描Li.A=0Aver=0Li.A=0Aver=0Li.A=2Aver=2Li.A=2Aver=011單向、雙向掃描功能：如果點(diǎn)擊Unidirectional、BidirectionalScan按鈕，會啟動雙向掃描模式，如果不點(diǎn)擊此按鈕，就默認(rèn)單項(xiàng)掃描模式單向掃描雙向掃描單位400800線數(shù)每秒8001600線數(shù)每秒10002000線數(shù)每秒12Speed掃描速度選擇功能：如果點(diǎn)擊Speed按鈕，會翻開掃描速度調(diào)節(jié)對話框，選擇不同掃描速度單向掃描單位400線數(shù)每秒（默認(rèn)值）800線數(shù)每秒1000線數(shù)每秒13Zoom電子放大1X2X4X8X16X32X64Xothers14一.概述二.影響共聚焦檢測質(zhì)量的主要設(shè)備參數(shù)三.因樣本的處理不當(dāng)影響共聚焦檢測質(zhì)量的因素四.樣本制作過程需要注意的問題15熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有：所使用的熒光探針濃度過低。2.標(biāo)記條件不適當(dāng)：孵育的時間、溫度不當(dāng)，大多數(shù)情況下都是樣品與探針孵育溫度太低或時間太短造成。3.熒光探針失效。這是一種很常見的標(biāo)記失敗原因。熒光探針一般要低溫保存、不要反復(fù)凍溶、應(yīng)用液現(xiàn)用現(xiàn)配制，另外其要在保質(zhì)期內(nèi)使用。16熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有：4.所用介質(zhì)、pH值不適當(dāng)。例如FITC：在pH6-8時，很難跨過完整的活細(xì)胞膜使之染色，但在。pH為9時，可以跨膜進(jìn)入細(xì)胞。5.細(xì)胞狀態(tài)不正常。例如，有一些探針只標(biāo)記活細(xì)胞，如果細(xì)胞活性不夠那么難以標(biāo)記上熒光。6.探針溶解不充分。雖然參加溶液的探針量足夠，但探針沒有完全溶解，因此，實(shí)際接觸細(xì)胞的探針濃度很低。17熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有：18熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有：熒光干擾。樣品中的自發(fā)熒光光譜范圍很寬，有時會干擾正常細(xì)胞染色，例如，葉綠素的自發(fā)熒光光譜范圍很寬且強(qiáng)度高，會覆蓋某些紅、黃、綠色熒光。10.熒光重合，例如。FITC的熒光光譜和GFP的熒光光譜在有很大一局部是重合的，在熒光顯微鏡下很難分開。因此如果不具備分開二者光譜的儀器設(shè)備，應(yīng)盡量防止二者同時出現(xiàn)在同一樣品中。19熒光標(biāo)記后樣品熒光強(qiáng)度低的可能原因有：11.觀察樣品熒光的條件不適宜。有時，雖然樣品已經(jīng)標(biāo)記了熒光，但是如果觀察樣品所使用的條件不適宜，也會觀察不到熒光。例如APC紅標(biāo)記的樣品，其最大激發(fā)波長為650nm，用一般熒光顯微鏡很難看到；共聚焦顯微鏡激光譜線中用633nm的激光譜線才能采集到其圖像。12.有淬滅劑存在。如果介質(zhì)中含有淬滅劑，也會使熒光下降或完全淬滅。⑥其他原因：例如，參加試劑種類、順序錯誤、漏加試劑及不當(dāng)?shù)牟僮骶蓪?dǎo)致熒光標(biāo)記失敗。20一.概述二.影響共聚焦檢測質(zhì)量的主要設(shè)備參數(shù)三.因樣本的處理不當(dāng)影響而共聚焦檢測質(zhì)量的因素四.樣本制作過程需要注意的問題21①標(biāo)本反復(fù)離心洗滌會造成細(xì)胞的粘附性降低，在免疫組化染色過程中容易脫片，因此在制備涂片前載玻片上應(yīng)涂粘附劑；②為節(jié)省試劑和便于鏡下觀察和記數(shù)，應(yīng)將細(xì)胞集中到直徑0.6～1.0cm的圓圈內(nèi)，細(xì)胞面積占視野的20%以上為宜；③粘液豐富的標(biāo)本如痰液、胃液等，未經(jīng)特殊處理，一般不宜作免疫組化標(biāo)記。〔一〕制備細(xì)胞涂片應(yīng)注意：22〔二〕固定組織時應(yīng)注意:①應(yīng)力求保持組織新鮮，勿使其枯燥，盡快固定處理；②組織塊不宜過大過厚，必須小于，尤其是組織塊厚度必須控制在0.3cm以內(nèi)；③固定液必須有足夠的量，在體積上一般大于組織20倍以上，否那么組織中心固定不良影響效果；④組織固定后應(yīng)充分水洗。23〔三〕薄片樣本〔ThinSamples〕對于單層培養(yǎng)的細(xì)胞，組織切片等較薄的樣品，主要是獲取高分辨率的圖像，由于介質(zhì)薄，因而折射系數(shù)的匹配問題不像厚樣品那么重要，故此可以用甘油作為介質(zhì)的物鏡〔63XGlyc、100XOil〕。24〔四〕厚片樣本〔ThickSamples〕對于厚樣本〔20－2mm〕在使用中應(yīng)注意：蓋玻片要貼緊樣本，不要留有空隙，以免工作距離不夠產(chǎn)生象差；采用工作距離足夠長的物鏡〔10X、20X或40X〕，不可以用油鏡，油鏡的工作距離短，會頂破蓋玻片，損壞樣本，甚至物鏡，且成像也不清晰；進(jìn)行斷層成像會有熒光損失，從而影響圖像的質(zhì)量，采取提高檢測針孔[Pinhole≥1(AU)],增加激光穿透性；在進(jìn)行“Continuous〞掃描時，找到最亮的層面進(jìn)行調(diào)焦調(diào)整相應(yīng)參數(shù)。25〔五〕玻片處理和涂膠對易造成細(xì)胞、組織脫片的問題采取以下兩措施，可防止脫片現(xiàn)象出現(xiàn)。1．載玻片和蓋玻片處理新載玻片上有油污，必須經(jīng)過清潔液浸泡12～24h，流水充分漂洗后用蒸餾水清洗5遍以上，浸泡在95％酒精內(nèi)2h，用綢布擦干或用紅外線烤箱烤干均可，貯放于玻片盒內(nèi)備用。蓋玻片很薄，以上處理程序必須縮短，清潔液浸泡只需2h，流水沖洗注意勿損傷玻片等。不主張用烘烤箱枯燥。2.載玻片上涂多聚賴氨酸液粘附劑；26〔六〕自發(fā)熒光〔Autofluorescence〕首先看它時什么顏色？在何部位，與靶區(qū)有何關(guān)聯(lián)？是否是雜質(zhì)？所選擇的熒光染料與之必須不同；亮度如何？如果太亮需要避開、減弱；是否需要它？通常情況下，有助于確定染色區(qū)的定位；來源何處？葉綠體、卵黃、膠原蛋白、還是其他的來源？淬滅、漂白；蘇丹黑可以淬滅脂質(zhì)的自發(fā)熒光；組織內(nèi)的自發(fā)熒光可以被硼氫化鈉淬滅。組織自發(fā)熒光淬滅劑AutoFluoQuencher27十.定位與定量測量應(yīng)注意的問題定位：1.Pinhole盡可能的為1AU；2.確認(rèn)共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像。定量：1.儀器的各個參數(shù)和樣本制作的條件必須一致；2.必須用原始圖像進(jìn)行定量測量；3.Pinhole盡可能的大。283-D樣本制備的根本原那么1、固定：2、是否需要切片？

激發(fā)的穿透力為50-500um取決于熒光探針對組織的滲透能力。