磷酸鋁與IL18作新城疫基因疫苗佐劑的探討何英杰吳思源鄧瑞林指導(dǎo)老師：黃青云[摘要]本研究的目的是探討傳統(tǒng)佐劑磷酸鋁與新型免疫佐劑分子IL－18聯(lián)合應(yīng)用，提高新城疫F基因疫苗免疫效果及其條件和機(jī)理。研究方法在原有已構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAF和雞白介素18基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNAcIL18的基礎(chǔ)上，大量提取質(zhì)粒pcDNAcIL18和pcDNAF，并進(jìn)行含量測定，加入適量佐劑磷酸鋁；分組免疫雞群，設(shè)立注射傳統(tǒng)疫苗和僅注射生理鹽水對照。各組免疫后以HI試驗(yàn)定期監(jiān)測血液的NDV抗體水平并進(jìn)行近期攻毒保護(hù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：使用磷酸鋁佐劑和IL18聯(lián)合與新城疫F基因疫苗經(jīng)2次免疫的雞群近期攻毒保護(hù)率比單用F基因疫苗的22.2％提高到了72.7％，雖然仍比不上傳統(tǒng)疫苗弱毒疫苗C30一次免疫88.9％，C30一免＋滅活疫苗二免100％的保護(hù)效果，但為NDVF基因疫苗的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用研究展現(xiàn)了前景，增強(qiáng)了信心。[關(guān)鍵詞]雞新城疫F基因疫苗IL18磷酸鋁新城疫是危害養(yǎng)雞業(yè)的A類傳染病。1990年美國已注冊NDVF基因重組雞痘病毒活載體苗VectorVAXFPN[1]。我國尚未有自主產(chǎn)權(quán)的DNA疫苗。導(dǎo)師黃青云教授指導(dǎo)研究生已成功構(gòu)建NDVF基因和雞白細(xì)胞介素18（IL18）基因真核表達(dá)載體pcDNAF與pcDNAcIL18，經(jīng)雞的初步免疫試驗(yàn)獲得了相當(dāng)?shù)拿庖咝Ч?，但有待提高[1][2]。本項(xiàng)目在已有免疫試驗(yàn)基礎(chǔ)上，參考國內(nèi)外最新報(bào)告，選用實(shí)用的傳統(tǒng)佐劑磷酸鋁[3－8]，探討其pcDNAcIL18共同作NDVF基因疫苗佐劑，提高免疫效果的作用及其條件和機(jī)理1實(shí)驗(yàn)材料和儀器1.1主要試驗(yàn)材料pcDNAF，pcDNAcIL18（導(dǎo)師提供）；磷酸鋁膠；DL15000DNAmarker，lambdaDNAHindIIIMarker，DL2000DNAmarker（購自廣州英韋創(chuàng)津生物科技）；PEG8000，LiCl，乙酸銨（購自廣州精科）；EDTA，TrisCl，NaOH，SDS，乙酸鉀，冰醋酸，異丙醇（購自廣州梓興）；NDV抗原，ND陽性血清、ND陰性血清（購自肇慶大華農(nóng)生物）；LB肉湯培養(yǎng)基（購自廣州市微生物研究所）；NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9（傳染病實(shí)驗(yàn)室賀東升副教授提供）；solutionⅠ：1.92g葡萄糖、160mL雙蒸水、4mL0.5mol/LEDTA、5mL1mol/LTrisCl（pH8.0），加雙蒸水定容至200mL，115℃20min滅菌，4℃solutionⅡ：0.2mol/LNaOH，1%（w/v）SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用；solutionⅢ：5mol/L乙酸鉀60mL、11.5mL冰醋酸、28.5mL雙蒸水；實(shí)驗(yàn)用嶺南黃雞130只（購自廣東智威畜牧水產(chǎn)）。1.2主要試驗(yàn)儀器電子天平（上海天平儀器廠）、TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、TDL5000B水平冰凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、TGL18R冰凍高速離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器）、恒溫水浴振蕩器（廣州天河精科化波儀器批發(fā)部）、JC303-4A電熱培養(yǎng)箱（上海嘉程儀器設(shè)備廠）、752紫外光冊分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）、DK8D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器）、HV30000多用電泳儀（北京東方儀器廠）、組織勻漿機(jī)（Flucko）、PCR儀（UNOⅡ<Biometra公司>）、瓊脂糖凝膠電泳槽(北京科普儀器廠)、紫外分析儀(上海四星生物技術(shù))、黑馬凝膠圖象分析儀(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器)、核酸與蛋白自動(dòng)檢測儀(Eppendorf)。2方法2.1重組質(zhì)粒PcDNAF和pcDNAcIL18的鑒定將含pcDNAF、pcDNAcIL18的基因工程苗JM109、cos7從－70℃冰箱取出，參照參考文獻(xiàn)[1][2]介紹的方法2.2pcDNAF與pcDNAcIL18質(zhì)粒的大量制備及含量測量參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（J.薩姆布魯克，1992）的聚乙二醇沉淀法[9]，大量提取、純化載體，操作如下：（1）分別將含有pcDNAF、pcDNAcIL18質(zhì)粒的JM109菌株按1％的濃度接種100mLLB液體培養(yǎng)基（Amp+）中，37℃150rpm（2）將菌液離心沉淀，沉淀物重懸于3mLsolutionⅠ中，劇烈震蕩混勻，隨后加入6mL新鮮配制的solutionⅡ，旋緊管蓋，緩慢顛倒離心管數(shù)次充分混勻，直至液體變透明、凝膠狀，冰浴10min；（3）加入預(yù)冷的4.5mLsolutionⅢ，混勻，冰浴20min，可見產(chǎn)生大量白色沉淀；（4）4℃7000rpm離心15min，小心收集上清至另一個(gè)離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，充分混勻，室溫靜置15～20min（5）室溫7000rpm離心15min，棄上清，于室溫用70％乙醇洗滌沉淀，棄凈乙醇，真空泵吸凈管壁所有液滴，風(fēng)干；（6）用適量TE（pH8.0）溶解沉淀，再加入等體積的5mol/LLiCl溶液，充分混勻，冰浴5min，4℃12000rpm（7）將上清轉(zhuǎn)移到另一新的離心管中，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置15min，室溫12000rpm離心10min，回收核酸沉淀；（8）棄上清，將離心管倒置以使最后殘留的液滴流盡，于室溫下用70％的乙醇洗滌2次，棄凈乙醇，真空泵吸干管壁所有液滴，風(fēng)干；（9）用適量含RNA酶（20μg/mL）的TE溶解沉淀，37℃（10）加入500μL含13％（w/v）PEG8000的1.6mol/LNaCl,充分混勻，4℃12000rpm（11）棄上清，用400μLTE溶解核酸沉淀，用酚及酚:氯仿:異戊醇（25：24：1）各抽提一次；（12）將水相轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管，加100μL10mol/L乙酸銨充分混勻，加2.5倍體積無水乙醇冰凍沉淀10～30min，室溫12000rpm離心10min；（13）以后所有操作轉(zhuǎn)到超凈臺(tái)中進(jìn)行，回收沉淀，棄去上清，用預(yù)冷的70％乙醇洗滌2次，在超凈臺(tái)中風(fēng)干；（14）用適量無菌TE溶解沉淀，-20（15）取2μL產(chǎn)物用核酸與蛋白自動(dòng)檢測儀測量質(zhì)粒DNA的含量和純度。2.3磷酸鋁、pcDNAF和pcDNAcIL18組合疫苗備制根據(jù)提取的pcDNAF與pcDNAcIL18含量，分別加入飽和磷酸鋁膠，使得每毫升液體中含pcDNAF和pcDNAcIL18各1000μg，含磷酸鋁500μg，在組織勻漿機(jī)上以8000r/min攪拌6min至充分混勻，20℃保存，備用。2.4實(shí)驗(yàn)雞分組與免疫將1d齡雛雞嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)至7d齡，免疫前，先隨機(jī)抽取24只測定雞群的ND母源抗體水平，經(jīng)檢測HI抗體滴度均低于1:4。按表5進(jìn)行分組與免疫。2.5免疫后HI抗體監(jiān)測2.5.1待測血清制備每組雞只于免疫后0、1、2、3、4周，隨機(jī)取5只，心臟采血0.5mL/只，分離血清，56℃30min滅活后作HI試驗(yàn)2.5.21％雞紅細(xì)胞懸液的配制靜脈采血非ND免疫成年健康公雞血2mL，以含3.8％枸櫞酸鈉的生理鹽水抗凝，用生理鹽水稀釋抗凝血，2000rpm離心洗滌，去上清液，重復(fù)3次。最后稀釋成1％紅細(xì)胞懸液。2.5.3NDV抗原HA滴度用微量法在U型反應(yīng)板上按表1進(jìn)行表1NDV抗原HA試驗(yàn)術(shù)式孔號1234567891011病毒稀釋度1：21：41：81：161：321：641:1281:2561:5121:1024紅細(xì)胞對照生理鹽水（μl）2525252525252525252525抗原（μl）25→25→25→25→25→25→25→25→25→25→棄去251％雞紅細(xì)胞液（μl）5050505050505050505050判定結(jié)果4+4+4+4+4+4+4+3+2++⑴能使50μl1％的雞紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)為NDV抗原的HA凝集價(jià)。本試驗(yàn)第7孔100％凝集，凝集價(jià)為1：128倍。⑵4個(gè)單位的NDV抗原凝集價(jià)＝凝集價(jià)/4。因此下述HI試驗(yàn)的4個(gè)單位的抗原為128/4＝32，即1：32倍稀釋。2.5.4免疫雞血清中ND抗體用微量法在U型反應(yīng)板上按表2進(jìn)行表2ND抗體的HI試驗(yàn)術(shù)式管號123456789陰性對照陽性對照空白對照血清稀釋倍數(shù)248163264128256512///生理鹽水（μL）252525252525252525//25待測血清（μL）25→25→25→25→25→25→25→25→25→25棄2525/4個(gè)單位抗原（μL）2525252525252525252525251%紅細(xì)胞液（μL）505050505050505050505050感作20~30℃判定結(jié)果——————2+3+4+—4+注：紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象分別以（＋）多少表示強(qiáng)弱程度：（4＋）為完全凝集，ChBC 片狀凝集，均勻布滿紅孔底，邊緣不整齊或折疊。（3＋）、（2＋）、（＋）為不同程度凝集，（－）為不凝集，ChBC沉于管底成小圓形，邊緣清晰整齊。凡能使4個(gè)凝集單位NDV凝集紅細(xì)胞的作用完全受到抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為凝集抑制價(jià)（HI效價(jià)）。2.6攻毒保護(hù)試驗(yàn)2.6.1NDV強(qiáng)毒株F48E9半數(shù)致死量(LD50)的測定用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9接種10d齡雞胚，37℃培養(yǎng)，收集24－48h死亡雞胚的尿囊液作10－2～10－7倍稀釋，每一稀釋度接種4只同批次非免疫雞，0.2mL/只，37℃孵育，觀察記錄各組死亡和存活雞數(shù)，用ReedMuench方法計(jì)算LD2.6.2攻毒一免組于一免后第28d，二免組于二免后第14d，同時(shí)分別每只用NDVF48E930個(gè)LD50肌注。攻毒后觀察兩周，統(tǒng)計(jì)死亡雞數(shù)，并作病理剖檢。3試驗(yàn)結(jié)果3.1pcDNAcIL18、pcDNAF質(zhì)粒PCR與雙酶切鑒定結(jié)果見圖1，圖2圖1、pcDNAcIL18質(zhì)粒PCR與雙酶切鑒定1.DNAMarkerDL20002.pcDNAcIL18PCR產(chǎn)物3.pcDNAcIL18HindⅢ、BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物4.lambdaDNAHindIIIMarker圖2、pcDNAF重組質(zhì)粒PCR與雙酶切鑒定1.DNAMarkerDL20002.pcDNAF基因PCR產(chǎn)物3.pcDNAFHindⅢ單酶切產(chǎn)物4.pcDNAFHindⅢ、BamHⅠ雙酶切產(chǎn)物5.DNAMarkerDL150003.2HI鑒測結(jié)果見表3，表4表3.一免各組HI鑒測結(jié)果：（㏒2）免疫周數(shù)NDVFNDVF+磷酸鋁NDVF+IL18NDVF+IL18+磷酸鋁傳統(tǒng)疫苗（C30）生理鹽水02.1252.0002.1252.0002.0002.12512.5002.5002.6253.0005.0002.00022.7253.0003.1253.5006.0002.12533.0003.2503.5003.7256.5002.00043.0003.5003.6253.8756.5001.500表4.二免各組HI鑒測結(jié)果：（㏒2）免疫周數(shù)NDVFNDVF+磷酸鋁NDVF+IL18NDVF+IL18+磷酸鋁傳統(tǒng)疫苗（滅活苗）生理鹽水02.0002.0002.1252.1252.0002.12512.5002.6252.6253.0005.1252.00022.7253.0003.1253.5006.1252.00033.2503.2503.6253.6256.5002.00043.5003.7253.8754.0007.0001.5003.3NDVF48E9半數(shù)致死量（LD50）測定結(jié)果用ReedMuench方法計(jì)算LD50為10－3..25。3.4攻毒死亡雞剖檢結(jié)果剖檢死雞，其新城疫病變很典型。大部分死雞雞冠和肉髯發(fā)紫，嚴(yán)重的發(fā)黑；口腔內(nèi)充滿黏液，嗉囔內(nèi)充滿硬結(jié)飼料或充滿氣體和液體；泄殖腔充血、出血、壞死、糜爛，帶有糞污；打開雞胃，可見腺胃乳頭出血，胃與肌胃交界及腺胃與食道交界處有明顯的帶狀出血，腸管黏膜充血、出血；剪開氣管，大部分雞喉氣管黏膜充血、出血；有些心冠溝脂肪出血。3.5近期攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果檢表5表5.攻毒免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果條件疫苗試驗(yàn)雞數(shù)攻毒死亡數(shù)存活數(shù)保護(hù)率一免（7d齡）二免（21d齡）對照組PcDNAFPcDNAF+磷酸鋁PcDNAF+IL18PcDNAF+磷酸鋁+IL18PcDNAFPcDNAF+磷酸鋁PcDNAF+IL18PcDNAF+磷酸鋁+IL18弱毒疫苗C30（7d齡1次）C30一免+滅活苗二免非免疫組生理鹽水（2次）99101012111211912107676856310102334466881202/9(22.2%)3/9(33.3%)3/10(30.0%)4/10(40.0%)4/12(33.3%)6/11(54.5%)6/12(50.0%)8/11(72.7%)8/9(88.9%)12/12(100%)0/10(0%)注:免疫劑量為PcDNAF，pcDNAcIL18（簡稱IL18）均每次200ug/只；磷酸鋁每次100ug/只；弱毒苗1頭份／只；ND滅活苗1頭份／只；生理鹽水每次0.2ｍｌ／只．4結(jié)果分析4.1圖1、圖2顯示pcDNAcIL18、pcDNAF的PCR與雙酶切電泳結(jié)果均分別出現(xiàn)大小約600bp(cIL18)及1700bp(F)條帶，表明兩種重組質(zhì)粒保存良好，可用。4.2各免疫試驗(yàn)組一免或二免后每周檢測新城疫HI抗體的曲線圖分別見圖3和圖4(周)(周)(Log2)((周)(周)(Log2)(Log2)圖3.一免的血清NDV抗體檢測情況圖4.二免的血清NDV抗體檢測情況注：圖中曲線：a為NDVF，b為NDVF+磷酸鋁，c為NDVF+IL18，d為NDVF+IL18+磷酸鋁，e為傳統(tǒng)疫苗，f為生理鹽水從圖3、圖4可以看出：一免與二免后每周的血清抗體水平高低均依次為傳統(tǒng)疫苗組>pcDNAF+磷酸鋁+IL18組>pcDNAF+IL18組>pcDNAF+磷酸鋁組>pcDNAF組>非免疫對照組，這與表5近期攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果中各組雞的保護(hù)情況相一致。4.3表5攻毒免疫保護(hù)試驗(yàn)表明：①一免與二免各組的免疫保護(hù)率高低次序也是傳統(tǒng)疫苗組>pcDNAF+磷酸鋁+IL18組>pcDNAF+IL18組>pcDNAF+磷酸鋁組>pcDNAF組>非免疫對照組；②磷酸鋁佐劑和IL18聯(lián)合與新城疫F基因疫苗經(jīng)過二次免疫雞的近期攻毒保護(hù)率達(dá)到8/11（72.7％），比雞單用NDVF基因疫苗一免的保護(hù)率2/9（22.2％）、二免保護(hù)率4/12（33.3％），分別提高了50.5％和39.4％，雖然仍比不上傳統(tǒng)疫苗弱毒疫苗C30一次免疫88.9％，C30＋滅活疫苗二免100％的保護(hù)效果，但試驗(yàn)表明新城疫F基因疫苗具有進(jìn)一步的研究﹑開發(fā)及應(yīng)用價(jià)值,也對其他DNA疫苗的開發(fā)應(yīng)用研究具有參考價(jià)值.5討論近幾年來，隨著我國獸醫(yī)衛(wèi)生事業(yè)的不斷發(fā)展，在疾病的預(yù)防與治療方面，取得了巨大的進(jìn)展。許多新型疫苗的研制成功為我國養(yǎng)禽業(yè)的不斷發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。但是，在臨床上仍有許多疾病，諸如雞新城疫、雞傳染性法氏囊、禽流感等疾病不斷發(fā)生[3－8]。本項(xiàng)目在高科技新型分子疫苗﹑新型分子佐劑與傳統(tǒng)疫苗佐劑聯(lián)合應(yīng)用方面作了探索。研究中發(fā)現(xiàn)，使用傳統(tǒng)佐劑磷酸鋁和pcDNAcIL18聯(lián)合作NDVF基因疫苗佐劑，并經(jīng)2次免疫，免疫雞的抗體水平和近期免疫保護(hù)率都得到顯著的提高，其機(jī)理可能是磷酸鋁具有保護(hù)新城疫F基因重組質(zhì)粒和pcDNAcIL18重組質(zhì)粒，使其不會(huì)很快被降解，表達(dá)時(shí)間可以持續(xù)延長，而持續(xù)表達(dá)的pcDNAcIL18則持續(xù)起分子佐劑的作用，因此提高抗體水平及免疫保護(hù)效果。本項(xiàng)研究結(jié)果啟示，若繼續(xù)選用更適宜的常規(guī)佐劑、進(jìn)一步試驗(yàn)pcDNAF和pcDNAcIL18的免疫劑量及聯(lián)合免疫程序等，可繼續(xù)提高NDVF基因疫苗的免疫效果，直至達(dá)到真正能在生產(chǎn)中應(yīng)用推廣。致謝本項(xiàng)目是在導(dǎo)師黃青云教授的悉心指導(dǎo)和深切關(guān)懷下完成的。一年來，在本項(xiàng)目的研究試驗(yàn)和論文撰寫過程中，我們得到導(dǎo)師的孜孜不倦的指導(dǎo)和關(guān)心，其諄諄教誨使我們不斷的進(jìn)步和成長、嚴(yán)謹(jǐn)敬業(yè)的奮斗精神將使我們受益終生。在此，謹(jǐn)向黃青云老師與此同時(shí)，本項(xiàng)目還得到了