DBS13河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布IDBS13/003—2015本標準按GB/T1.1-2009規(guī)定的格式編寫。本標準由河北省衛(wèi)生和計劃生育委員會歸口。本標準于2015年4月23日首次發(fā)布。1DBS13/003—2015食品安全地方標準阪崎腸桿菌和沙門氏菌檢測本標準適用于應用實時熒光定量PCR法定性檢測阪崎腸桿菌和沙門氏菌。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.4食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗。GB4789.40食品安全國家標準食品微生物學檢驗阪崎腸桿菌檢驗。3方法提要阪崎腸桿菌和沙門氏菌均屬于腸桿菌科，本檢測方法首先對腸桿菌科和阪崎腸桿菌進行同步檢測。當腸桿菌科為陰性時可直接報告沙門氏菌陰性；當腸桿菌科為陽性時再進行沙門氏菌的檢測；當阪崎腸桿菌為陽性時需按照GB4789.40進行確證；當沙門氏菌為陽性時需按照GB4789.4進行確證。4設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：4.1二級生物安全柜4.2磁力攪拌器：0-2400r/min。4.3鹵素燈：500W。4.4低溫離心管架：1.5mL，0℃。4.5水浴鍋或金屬恒溫加熱器：5℃-100℃。4.6漩渦振蕩器。4.7離心機：12000r/min。4.8移液器及對應吸頭：10μL、100μL、200μL、1000μL。4.9超凈工作臺。4.10實時熒光定量PCR儀（含有FAM-,HEX-和ROX-檢測通道）。4.11冰箱：2℃—8℃和-20℃兩種。DBS13/003—201524.12天平：感量0.1g。4.130.2mL8聯(lián)排管以及8聯(lián)排帽（與PCR儀配套使用）。4.141.5mL無菌透明離心管。4.16無菌錐形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。5培養(yǎng)基和試劑除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純。5.1緩沖蛋白胨水（BPW）：見附錄A.1。5.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）：見附錄A.2。5.3125μg/mL溴化乙錠單疊氮溴溶液（EMA）：見附錄A.3。5.4DNA提取緩沖液:0.1%Chelex100（螯合樹脂）水溶液。5.5吐溫80。5.6按照表1和表4的序列合成的引物和標記的探針。5.7TaqDNA聚合酶：5U/μL。5.8TaqPCR緩沖液。5.950mmol/LMgCl2溶液：見附錄A.4。5.10dNTPs（dATP,dUTP,dCTP,dGTP），濃度均為10mmol/L。5.11尿嘧啶-N-糖基化酶：1U/μL。5.12pUC19質(zhì)粒DNA，200拷貝/μL。5.13阪崎腸桿菌質(zhì)控菌株：ATCC29544，或等效菌株。5.14沙門氏菌質(zhì)控菌株：ATCC13311，或等效菌株。5.15大腸桿菌質(zhì)控菌株：ATCC10536，或等效菌株。5.16金黃色葡萄球菌：CICC10301，或其它非腸桿菌科的陰性質(zhì)控等效菌株。6檢驗程序檢驗程序見圖1。DBS13/003—20153檢樣檢樣100g（mL）加入到900mLBPW中進行首次增菌50μL50μL首次增菌樣品加入到450μLBPW中進行二次增菌100μL100μL二次增菌樣品加入到EMA溶液中（滅活死亡細胞的DNA） DNA的提取實時熒光定量PCR檢測GB4789.40、GB4789.4進行確證圖1檢驗程序結(jié)果報告7操作步驟7.1首次增菌稱取樣品100g（mL）加入到900mL預熱至37℃的BPW中，充分混勻，36℃1℃培養(yǎng)16h–對于含有超過20%脂肪含量的樣品，需要在BPW中加入1g/L（每10%脂肪含量）的吐溫80。7.2二次增菌充分搖勻首次增菌液，吸取50μL轉(zhuǎn)種于450μL預熱至37℃的BPW中，36℃1℃培養(yǎng)3h–4h。7.3樣品模板DNA的制備7.3.1吸取100μL二次增菌液加入到1.5mL無菌透明離心管中；加入400μLEMA溶液，室溫下暗室培養(yǎng)5min。7.3.2將離心管放入低溫離心管架中，置于500W鹵素燈正下方，相距15cm-20cm，曝光5min后，10000r/min離心5min。7.3.3用移液器移除上清液，加入200μLDNA提取緩沖液，充分混勻后，置于95℃-100℃水浴鍋或金屬恒溫加熱器中維持10min。7.3.4室溫下靜置1min，振蕩混勻，12000r/min離心2min，上清液即為DNA模板。7.4質(zhì)控菌株模板DNA的制備DBS13/003—20154分別接種供試的陽性對照菌株（大腸桿菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌）和陰性對照菌株（金黃色葡萄球菌）到10mLNB培養(yǎng)液中，36℃1℃培養(yǎng)過夜，各取1.5mL增菌液，同上離心、提取DNA模板。7.5PCR反應所用引物和探針工作液的配制根據(jù)表1反應體系中每種引物和探針的終濃度，使用滅菌去離子水配制含有6種目標基因引物的工作液（濃度分別為10μmol/L）和含有3種探針的工作液（濃度分別為10μmol/L）。表1目標基因引物和探針序列及每個反應體系內(nèi)的終濃度終濃度(μmol/L）5′-CTGAAAGCATCTAAG5′-FAM-CCCGAGATGAGTTCTCCCTGASMCTTTAA5′-HEX-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAA5′-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCG7.6模板DNA熒光PCR反應體系的配制每個樣品按照表2的加液量配制25μL反應體系。表2目標基因擴增體系配制表加樣體積(μL）每次進行PCR反應均需使用pUC19質(zhì)粒DNA作為內(nèi)部擴增對照，并設(shè)置陽性、陰性和空白對照（滅菌去離子水）。7.7腸桿菌科和阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測將配制完成的反應管放入實時熒光定量PCR儀中，按照如下步驟設(shè)置反應條件：反應步驟一：預變性，37℃4min，95℃5min，1個循環(huán)；5反應步驟二：擴增和信號收集，95℃變性10s，65℃退火和延伸（每個循環(huán)降低0.1℃)70s，40個循環(huán)，同時收集FAM，HEX和ROX的熒光信號。核查反應條件正確后，啟動反應程序。7.8結(jié)果判讀當檢測樣本Ct值小于或等于35時，報告為陽性；Ct值大于35且小于40時，需要重復一次，如果Ct值仍小于40，且曲線有明顯的對數(shù)增長期，報告為陽性，否則為陰性；樣本沒有Ct值時，報告為陰性。具體結(jié)果判定參照表3。表3腸桿菌科和阪崎腸桿菌結(jié)果判讀表當FAM通道為陽性，HEX通道為陽性時，可報告腸桿菌科和阪崎腸桿菌陽性；當FAM通道為陽性，HEX通道為陰性時，可報告腸桿菌科陽性但阪崎腸桿菌陰性；當FAM通道為陰性，HEX通道為陰性，ROX通道為陽性時，可報告腸桿菌科和阪崎腸桿菌陰性；當FAM通道，HEX通道和ROX通道均為陰性時，為無效的結(jié)果應重做實驗。當腸桿菌科和阪崎腸桿菌均為陰性時，可報告沙門氏菌陰性；當腸桿菌科為陽性時，需要按下一步驟進一步單獨確證樣本中是否含有沙門氏菌。7.9沙門氏菌的確證實驗DNA模板可直接采用7.3已制備的樣品DNA模板。7.9.1PCR反應所用引物和探針工作液的配制根據(jù)表4反應體系中每種引物和探針的終濃度，使用滅菌去離子水配制含有4種目標基因引物的工作液（濃度分別為10μmol/L）和含有2種探針的工作液（濃度分別為10μmol/L）。表4目標基因引物和探針序列及每個反應體系內(nèi)的終濃度終濃度(μmol/L）5′-FAM-TTTTTCCTCGCTGGCTACCGCTT5′-ROX-TAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCG7.9.2PCR檢測體系的配制每個樣品按照表5的加液量配制25μL反應體系。6表5目標基因擴增體系配制表加樣體積(μL）7.9.3PCR檢測將配制完成的反應管放入實時熒光定量PCR儀中，按照如下步驟設(shè)置反應條件：反應步驟一：預變性，37℃4min，95℃5min，1個循環(huán)；反應步驟二：擴增和信號收集，95℃變性5s，60℃退火和延伸60s，50個循環(huán)，同時收集FAM和ROX的熒光信號。核查反應條件正確后，啟動反應程序。7.9.4結(jié)果判讀檢測樣本Ct值小于或等于40時，報告為陽性；Ct值大于40且小于50時，需要重復一次，如果Ct值仍小于50，且曲線有明顯的對數(shù)增長期，報告為陽性，否則為陰性；樣本沒有Ct值時，報告為陰性。具體結(jié)果判定參照表6。表6沙門氏菌結(jié)果判讀表當FAM通道為陽性時，可報告沙門氏菌陽性；當FAM通道為陰性，ROX通道為陽性時，可報告沙門氏菌陰性；當FAM通道和ROX通道均為陰性時，為無效的結(jié)果應重做實驗。8報告8.1篩選阪崎腸桿菌和沙門氏菌陽性的樣品，需分別按GB4789.40、GB4789.4進行確證。8.2報告每100g（mL）樣本中檢出或者未檢出阪崎腸桿菌和沙門氏菌。DBS13/003—20157（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基和試劑的配制除有特殊說明外，所有實驗用試劑均為分析純。A.1緩沖蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨氯化鈉磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）磷酸二氫鉀蒸餾水pH7.2A.1.2制法加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌15min。A.2營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）A.2.1成分蛋白胨牛肉粉氯化鈉蒸餾水pH7.2A.2.2制法加熱攪拌至溶解,調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌15min。A.3125μg/mL溴化乙錠單疊氮溴溶液（EMA）A.3.1成分溴化乙錠單疊氮溴滅菌超純水A.3.2制法將125mg溴化乙錠單疊氮溴加至1000mL滅菌超純水中，混勻。A.450mmol/L的MgC