Hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及分子機(jī)制探究一、緒論1.1研究背景與意義乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)226萬人，首次超過肺癌，成為“全球第一大癌”。在中國，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率的增長速度超過全球平均水平。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳、激素、生活方式等多種因素。其中，遺傳因素在乳腺癌的發(fā)生中起著重要作用，約5%-10%的乳腺癌患者具有明確的遺傳傾向，與乳腺癌相關(guān)的基因包括BRCA1、BRCA2、P53等。此外，雌激素水平過高、初潮早、絕經(jīng)晚、晚生育、不生育、不進(jìn)行母乳喂養(yǎng)等因素也會(huì)增加乳腺癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的乳腺癌治療方法主要包括手術(shù)、化療、放療和內(nèi)分泌治療等，這些治療方法在一定程度上提高了乳腺癌患者的生存率，但對于晚期乳腺癌患者或?qū)鹘y(tǒng)治療方法耐藥的患者，治療效果仍然不理想，患者的預(yù)后較差。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和治療方法，對于提高乳腺癌的治療效果和患者的生存率具有重要意義。MicroRNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為22個(gè)核苷酸，通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）特異性結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNA的降解或阻遏其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。近年來，越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著重要作用，成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。hsa-miR-365a作為miRNA家族的一員，其在乳腺癌中的作用逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，hsa-miR-365a在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平明顯降低，且其表達(dá)水平與乳腺癌患者的臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-365a可以通過調(diào)控多個(gè)靶基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。然而，目前關(guān)于hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制的研究還較少，其具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在探討hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。通過研究hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，以及其對相關(guān)信號(hào)通路和靶基因的調(diào)控作用，有望揭示hsa-miR-365a在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，為乳腺癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)后評估提供新的思路和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)于hsa-miR-365a和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究取得了一定的進(jìn)展。在國外，對hsa-miR-365a的研究起步較早，研究范圍也較為廣泛。有研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-365a在多種腫瘤中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在結(jié)直腸癌中，hsa-miR-365a-3p通過結(jié)合BMI1基因下調(diào)干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。在肝細(xì)胞癌中，hsa-miR-365a通過靶向調(diào)控多個(gè)基因，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。對于乳腺癌細(xì)胞MCF-7，國外研究人員對其生物學(xué)特性、信號(hào)通路以及耐藥機(jī)制等方面進(jìn)行了深入研究。有研究表明，MCF-7細(xì)胞具有雌激素受體陽性的特點(diǎn)，對內(nèi)分泌治療較為敏感。此外，MCF-7細(xì)胞中存在多條信號(hào)通路的異常激活，如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的激活與MCF-7細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在國內(nèi)，對hsa-miR-365a和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究也逐漸增多。有研究報(bào)道，在乳腺癌組織中，hsa-miR-365a的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且其低表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-365a可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。在對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究中，國內(nèi)學(xué)者主要關(guān)注其耐藥機(jī)制以及新型治療靶點(diǎn)的探索。有研究表明，MCF-7細(xì)胞對多種化療藥物存在耐藥現(xiàn)象，其耐藥機(jī)制可能與藥物外排泵的高表達(dá)、凋亡相關(guān)蛋白的異常調(diào)節(jié)以及信號(hào)通路的激活等因素有關(guān)。此外，國內(nèi)研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些與MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的分子靶點(diǎn)，為乳腺癌的治療提供了新的思路。盡管國內(nèi)外在hsa-miR-365a和乳腺癌細(xì)胞MCF-7的研究方面取得了一定的成果，但目前關(guān)于hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制的研究還存在一些不足之處。例如，hsa-miR-365a在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的具體作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路尚未完全明確，其與其他分子之間的相互作用關(guān)系也有待進(jìn)一步深入研究。此外，目前的研究大多局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，缺乏臨床研究的驗(yàn)證，因此，需要進(jìn)一步開展相關(guān)的臨床研究，以明確hsa-miR-365a在乳腺癌治療中的應(yīng)用價(jià)值。1.3研究內(nèi)容與方法本研究主要聚焦于hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制探究，具體研究內(nèi)容和方法如下：研究內(nèi)容：hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞增殖的影響：通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法、CCK-8法等實(shí)驗(yàn)方法，檢測過表達(dá)或抑制hsa-miR-365a后MCF-7細(xì)胞的增殖能力變化，觀察細(xì)胞生長曲線，明確hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV-FITC/PI雙染法等技術(shù)，分析hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響，同時(shí)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探究hsa-miR-365a誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的影響：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法，評估hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，觀察細(xì)胞的遷移和侵襲情況，揭示hsa-miR-365a在抑制MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面的作用。hsa-miR-365a的靶基因及相關(guān)信號(hào)通路研究：利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測hsa-miR-365a的潛在靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Westernblot等技術(shù)，驗(yàn)證靶基因與hsa-miR-365a的相互作用關(guān)系。進(jìn)一步研究靶基因參與的信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，明確hsa-miR-365a抑制MCF-7細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。研究方法：細(xì)胞培養(yǎng)：將乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將hsa-miR-365a模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測，以實(shí)現(xiàn)對hsa-miR-365a表達(dá)水平的調(diào)控。RNA提取和定量PCR：使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測hsa-miR-365a及相關(guān)靶基因mRNA的表達(dá)水平，以U6或β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。蛋白質(zhì)提取和Westernblot：用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，加入一抗和二抗孵育，最后通過化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：將含有潛在靶基因3’UTR的熒光素酶報(bào)告載體與hsa-miR-365a模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，48小時(shí)后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，驗(yàn)證hsa-miR-365a與靶基因的靶向結(jié)合關(guān)系。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1MicroRNA概述MicroRNA（miRNA）作為一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，自被發(fā)現(xiàn)以來，便在生命科學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了廣泛而深入的研究熱潮。1993年，維克托?安布羅斯（VictorAmbros）和他的團(tuán)隊(duì)在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)microRNA——lin-4，這一開創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)宛如一把鑰匙，開啟了人們探索miRNA神秘世界的大門。同年，加里?魯夫昆（GaryRuvkun）進(jìn)一步闡明了microRNA的作用機(jī)制，為后續(xù)的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，越來越多的miRNA在不同物種中被相繼發(fā)現(xiàn)，極大地豐富了人們對這一領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA長度約為21-23個(gè)核苷酸，是一種進(jìn)化上高度保守的單鏈小RNA分子。這種短小精悍的結(jié)構(gòu)賦予了miRNA獨(dú)特的生物學(xué)功能，使其能夠在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。其生成過程是一個(gè)精細(xì)而復(fù)雜的生物學(xué)過程，大部分miRNA位于mRNA宿主基因的內(nèi)含子中，并與宿主基因共享調(diào)控元件和初級轉(zhuǎn)錄物，具有相似的表達(dá)模式。首先，miRNA通過RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄為名為pri-miRNA的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該產(chǎn)物包含5'端帽子和polyA尾巴。隨后，pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)過由RNaseIII酶Drosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha/DGCR8組成的復(fù)合物的精確處理，生成長度約為70個(gè)核苷酸的pre-miRNA，pre-miRNA會(huì)折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。接著，pre-miRNA通過karyopherinexportin5（Exp5）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被精準(zhǔn)地輸出到細(xì)胞質(zhì)中。一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，pre-miRNA便會(huì)在RNAseIII酶Dicer的作用下，加工產(chǎn)生長度約為22個(gè)核苷酸的雙鏈RNA。同時(shí)，Dicer還會(huì)啟動(dòng)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC，RNAinducedsilentcomplex）的形成，RISC在miRNA表達(dá)和RNA干擾導(dǎo)致的基因沉默過程中發(fā)揮著不可或缺的介導(dǎo)作用。miRNA的作用機(jī)制主要是在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的互補(bǔ)程度較高時(shí)，RISC會(huì)介導(dǎo)靶mRNA的切割，使其降解，從而直接阻斷基因的表達(dá)；而當(dāng)miRNA與靶基因mRNA的互補(bǔ)程度較低時(shí)，RISC則會(huì)通過抑制翻譯過程，阻止蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而間接調(diào)控基因表達(dá)。值得注意的是，單個(gè)miRNA可以同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)不同的基因表達(dá)，反之，單個(gè)基因也可以受到多個(gè)miRNA的協(xié)同調(diào)控，這種復(fù)雜而精妙的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過程進(jìn)行全面而細(xì)致的調(diào)節(jié)。在生物過程中，miRNA發(fā)揮著廣泛而重要的功能，涵蓋了個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、分化、代謝等多個(gè)關(guān)鍵方面。在個(gè)體發(fā)育過程中，miRNA參與了胚胎發(fā)育的各個(gè)階段，對細(xì)胞的分化和組織器官的形成起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。例如，在胚胎干細(xì)胞的分化過程中，特定的miRNA表達(dá)模式會(huì)引導(dǎo)干細(xì)胞向不同的細(xì)胞譜系分化，確保胚胎的正常發(fā)育。在細(xì)胞凋亡方面，miRNA可以通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞的生死命運(yùn)。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)的觸發(fā)時(shí)，miRNA會(huì)迅速響應(yīng)，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)或抑制細(xì)胞凋亡程序，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。此外，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中也扮演著極為關(guān)鍵的角色，其異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等密切相關(guān)。一些miRNA可以作為抑癌基因，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用；而另一些miRNA則可能作為癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，加速腫瘤的進(jìn)展。2.2乳腺癌與MCF-7細(xì)胞乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程和分子機(jī)制。正常乳腺上皮細(xì)胞在多種致癌因素的作用下，如遺傳因素、激素水平失衡、環(huán)境因素等，發(fā)生基因突變和表觀遺傳改變，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、細(xì)胞周期紊亂以及細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)，最終發(fā)展為乳腺癌。在遺傳因素方面，BRCA1和BRCA2基因突變是乳腺癌的重要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素，攜帶這些突變的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。激素水平失衡，尤其是雌激素和孕激素水平的異常波動(dòng)，也在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。雌激素可以通過與雌激素受體（ER）結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖和存活，長期的雌激素刺激可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。此外，環(huán)境因素如長期暴露于化學(xué)致癌物、輻射、生活方式因素（如高脂肪飲食、缺乏運(yùn)動(dòng)、長期精神壓力等）也可能增加乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已成為全球女性最常見的惡性腫瘤，新發(fā)病例數(shù)高達(dá)226萬，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%。在中國，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)，2020年中國女性乳腺癌新發(fā)病例約為42萬，發(fā)病率為59.0/10萬。乳腺癌的發(fā)病率不僅在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢，而且發(fā)病年齡也逐漸年輕化，對女性的身心健康造成了嚴(yán)重威脅。不同地區(qū)和人群的乳腺癌發(fā)病率存在一定差異，歐美國家的乳腺癌發(fā)病率相對較高，而亞洲國家的發(fā)病率相對較低，但近年來亞洲國家的發(fā)病率增長速度較快。乳腺癌的死亡率也較高，是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法和預(yù)防策略，對于降低乳腺癌的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。MCF-7細(xì)胞是一種經(jīng)典的乳腺癌細(xì)胞系，于1970年由Soule等從一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立。該細(xì)胞系具有上皮樣細(xì)胞形態(tài)，呈貼壁生長，保留了多個(gè)分化了的乳腺上皮的特性。MCF-7細(xì)胞表達(dá)雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR），屬于雌激素受體陽性（ER+）的乳腺癌細(xì)胞，對雌激素的刺激較為敏感。雌激素可以通過與MCF-7細(xì)胞表面的雌激素受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。此外，MCF-7細(xì)胞還能通過胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇并能形成圓形復(fù)合（domes），這一特性使其在研究雌激素對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制方面具有重要價(jià)值。腫瘤壞死因子α（TNFα）可以抑制MCF-7細(xì)胞的生長，抗雌激素處理細(xì)胞能調(diào)變IGFBP＇S的分泌，這些特性使得MCF-7細(xì)胞成為研究乳腺癌發(fā)病機(jī)制、治療靶點(diǎn)以及藥物敏感性等方面的重要工具。在乳腺癌研究中，MCF-7細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。由于其對雌激素的敏感性，MCF-7細(xì)胞常用于研究雌激素受體信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。通過調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)水平或給予雌激素刺激，研究人員可以深入探討雌激素如何調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，以及相關(guān)信號(hào)通路的激活和調(diào)控機(jī)制。MCF-7細(xì)胞也被用于篩選和評估抗雌激素藥物的療效。許多抗雌激素藥物，如他莫昔芬、來曲唑等，通過抑制雌激素受體的活性或阻斷雌激素與受體的結(jié)合，發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞生長的作用。利用MCF-7細(xì)胞模型，可以研究這些藥物的作用機(jī)制、藥物敏感性以及耐藥機(jī)制，為臨床乳腺癌的內(nèi)分泌治療提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外，MCF-7細(xì)胞還可用于研究乳腺癌的其他發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)，如信號(hào)通路的異常激活、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控等。通過對MCF-7細(xì)胞的研究，有助于深入了解乳腺癌的生物學(xué)特性，為開發(fā)新的治療方法和藥物提供線索。2.3c-Myc與腫瘤關(guān)系c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著關(guān)鍵角色，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及胚胎生成等過程進(jìn)行著精細(xì)而全面的調(diào)控。c-Myc基因所編碼的蛋白質(zhì)由439個(gè)氨基酸組成，具備多種結(jié)構(gòu)域，包括bHLH（堿性螺旋-環(huán)-螺旋）、亮氨酸拉鏈（Leuzipper）以及轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域等。這些結(jié)構(gòu)域賦予了c-Myc獨(dú)特的生物學(xué)功能，使其能夠與特定的DNA序列結(jié)合，從而啟動(dòng)或抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程。c-Myc蛋白通過與Max蛋白形成異源二聚體，特異性地結(jié)合到DNA的E-box序列（5'-CACGTG-3'）上。一旦結(jié)合，c-Myc-Max異源二聚體便會(huì)招募一系列轉(zhuǎn)錄共激活因子，如p300/CBP等，這些共激活因子能夠修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)RNA聚合酶II與基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，進(jìn)而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。通過這種方式，c-Myc可以調(diào)控眾多下游靶基因的表達(dá)，這些靶基因涉及細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、代謝、凋亡等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過程。在細(xì)胞增殖過程中，c-Myc發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。c-Myc可以直接調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)DNA復(fù)制相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。c-Myc還能調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞周期相關(guān)的基因，如CyclinE、CDK2等，進(jìn)一步確保細(xì)胞周期的正常進(jìn)行和細(xì)胞的持續(xù)增殖。在細(xì)胞分化方面，c-Myc的作用則較為復(fù)雜，它通常抑制細(xì)胞的分化過程。以成肌細(xì)胞分化為例，在成肌細(xì)胞向肌管細(xì)胞分化的過程中，c-Myc的表達(dá)水平會(huì)逐漸降低。高表達(dá)的c-Myc會(huì)抑制肌肉特異性基因的表達(dá)，如MyoD、Myf5等，這些基因是肌肉分化的關(guān)鍵調(diào)控因子，它們的表達(dá)受到抑制會(huì)阻礙成肌細(xì)胞的分化進(jìn)程。相反，當(dāng)c-Myc表達(dá)下調(diào)時(shí)，肌肉特異性基因得以表達(dá)，成肌細(xì)胞逐漸分化為成熟的肌管細(xì)胞。c-Myc在胚胎生成過程中也起著不可或缺的作用，它參與了胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控。在胚胎發(fā)育的早期階段，c-Myc的高表達(dá)有助于維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新能力。隨著胚胎的發(fā)育，c-Myc的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，以調(diào)控不同細(xì)胞譜系的分化和組織器官的形成。正常細(xì)胞中，c-Myc基因的表達(dá)受到嚴(yán)格而精密的調(diào)控，其表達(dá)水平處于一個(gè)相對穩(wěn)定的狀態(tài)，以確保細(xì)胞的正常生理功能。生長因子、細(xì)胞因子等信號(hào)分子可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK、PI3K/AKT等信號(hào)通路，來調(diào)節(jié)c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子的刺激時(shí)，Ras蛋白被激活，進(jìn)而激活下游的Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化激活ERK激酶，ERK激酶進(jìn)入細(xì)胞核后，磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，Elk-1與c-Myc基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞內(nèi)還存在著負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，以防止c-Myc的過度表達(dá)。c-Myc蛋白可以誘導(dǎo)其自身的負(fù)調(diào)控因子如Mad1、Mxi1等的表達(dá)，Mad1、Mxi1等蛋白能夠與Max蛋白形成異源二聚體，競爭性地結(jié)合到c-Myc的DNA結(jié)合位點(diǎn)上，從而抑制c-Myc的轉(zhuǎn)錄活性，維持c-Myc表達(dá)的平衡。一旦這種調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致c-Myc基因的異常表達(dá)，便會(huì)對細(xì)胞的正常生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，進(jìn)而引發(fā)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在眾多人類惡性腫瘤中，如淋巴癌、神經(jīng)細(xì)胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及肝癌等，都能觀察到c-Myc基因的過度表達(dá)或基因擴(kuò)增現(xiàn)象。在乳腺癌中，c-Myc基因的擴(kuò)增和過表達(dá)較為常見，研究表明，約20%-30%的乳腺癌患者存在c-Myc基因的擴(kuò)增。c-Myc的異常高表達(dá)被認(rèn)為是腫瘤的一個(gè)重要分子標(biāo)志，它可以通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。c-Myc可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使腫瘤細(xì)胞能夠快速增殖。c-Myc還能抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如Bcl-2家族成員等，抑制細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的激活，從而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡的命運(yùn)。此外，c-Myc還參與腫瘤細(xì)胞的代謝重編程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對葡萄糖、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用，為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中，c-Myc也發(fā)揮著重要作用，它可以上調(diào)一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜，侵入周圍組織和血管，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。三、hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞抑制作用實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞株：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自美國Gibco公司；hsa-miR-365a模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對照（NC）由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix購自日本TaKaRa公司；兔抗人c-Myc、Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、PCNA、MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK抗體以及HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國CellSignalingTechnology公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、PMSF購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、PCR儀（美國Bio-Rad公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國AppliedBiosystems公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、酶標(biāo)儀（美國ThermoFisherScientific公司）。實(shí)驗(yàn)方法：細(xì)胞培養(yǎng)：將MCF-7細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1:3-1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)，確保細(xì)胞生長良好。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：采用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將hsa-miR-365a模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中。具體操作如下：轉(zhuǎn)染前1天，將MCF-7細(xì)胞以1×10?/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%。將hsa-miR-365a模擬物、抑制劑或陰性對照與Lipofectamine3000試劑分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時(shí)，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNA提取和定量PCR：使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體步驟如下：收集轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞，加入1mlTRIzol試劑，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5分鐘。加入200μl***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μl異丙醇，混勻后室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀用75%乙醇洗滌2次。晾干后，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，要求A???/A???比值在1.8-2.0之間。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreenPCRMasterMix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系為20μl，包括10μlSYBRGreenPCRMasterMix、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、1μlcDNA和8μlddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。以U6作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算hsa-miR-365a的相對表達(dá)量。引物序列如下：hsa-miR-365a上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAGCCTGTAGTGAAAG-3'，下游引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACACTT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。蛋白質(zhì)提取和WesternBlot：用RIPA裂解液（含1%PMSF）提取細(xì)胞總蛋白。具體步驟如下：收集轉(zhuǎn)染后的MCF-7細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次。加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷振蕩。4℃、12000rpm離心15分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳分離，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在室溫下封閉PVDF膜1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（c-Myc、Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3、PCNA、MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK等抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影，檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參蛋白，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值，以表示目的蛋白的相對表達(dá)量。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：利用生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan、miRanda等預(yù)測hsa-miR-365a的潛在靶基因，并構(gòu)建含有靶基因3’UTR的熒光素酶報(bào)告載體。具體步驟如下：根據(jù)預(yù)測的靶基因3’UTR序列，設(shè)計(jì)并合成引物，通過PCR擴(kuò)增獲得靶基因3’UTR片段。將擴(kuò)增得到的3’UTR片段克隆到pGL3-Basic熒光素酶報(bào)告載體中，構(gòu)建重組報(bào)告載體。將重組報(bào)告載體與hsa-miR-365a模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)染pRL-TKRenilla熒光素酶報(bào)告載體作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒的說明書進(jìn)行檢測。使用酶標(biāo)儀測定螢火蟲熒光素酶活性和Renilla熒光素酶活性，計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與Renilla熒光素酶活性的比值，以表示熒光素酶的相對活性。若hsa-miR-365a模擬物轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對活性顯著低于陰性對照轉(zhuǎn)染組，則說明hsa-miR-365a與靶基因3’UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在進(jìn)行c-Myc特異性siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)，以正常培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞作為空白對照組，轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的MCF-7細(xì)胞作為陰性對照組。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測c-Myc的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，c-Myc特異性siRNA轉(zhuǎn)染組的c-MycmRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），其中c-MycmRNA表達(dá)的抑制強(qiáng)度達(dá)80%以上。這表明c-Myc特異性siRNA能夠有效地抑制MCF-7細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，采用血清依賴性細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)和飽和密度實(shí)驗(yàn)檢測c-Myc表達(dá)抑制對MCF-7細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，c-Myc特異性siRNA介導(dǎo)的c-Myc表達(dá)抑制可使MCF-7細(xì)胞的增殖明顯減緩。在血清依賴性細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)中，c-Myc特異性siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞生長曲線明顯低于空白對照組和陰性對照組，細(xì)胞增殖速度顯著降低。在飽和密度實(shí)驗(yàn)中，c-Myc特異性siRNA轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞飽和密度明顯低于空白對照組和陰性對照組，表明細(xì)胞的增殖能力受到了顯著抑制。這說明降低c-Myc的表達(dá)可以有效抑制MCF-7細(xì)胞的生長。同時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測抑制MCF-7細(xì)胞c-Myc表達(dá)后細(xì)胞內(nèi)hsa-miR-365a水平的變化。結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，c-Myc特異性siRNA轉(zhuǎn)染組的hsa-miR-365a水平顯著升高（P<0.01）。這表明抑制MCF-7細(xì)胞的c-Myc表達(dá)可顯著升高細(xì)胞內(nèi)hsa-miR-365a水平，提示c-Myc可能對hsa-miR-365a的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。為了進(jìn)一步探究hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞增殖的影響，將hsa-miR-365a模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，hsa-miR-365a模擬物轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞吸光度值顯著降低（P<0.01）；而hsa-miR-365a抑制劑轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖能力則有所增強(qiáng)，細(xì)胞吸光度值顯著升高（P<0.01）。這表明hsa-miR-365a模擬物可明顯抑制MCF-7細(xì)胞的惡性增殖，而其抑制劑則可幾乎完全取消hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，說明hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞的增殖具有抑制作用。四、hsa-miR-365a抑制MCF-7細(xì)胞的機(jī)制探究4.1靶基因預(yù)測與驗(yàn)證為深入探究hsa-miR-365a抑制MCF-7細(xì)胞的潛在分子機(jī)制，本研究借助生物信息學(xué)預(yù)測工具，如TargetScan、miRanda等，對hsa-miR-365a的靶基因展開預(yù)測。這些工具依據(jù)miRNA與靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)配對原則，通過算法和數(shù)據(jù)庫比對，預(yù)測出可能與hsa-miR-365a相互作用的靶基因。在運(yùn)用TargetScan預(yù)測時(shí)，其算法基于對多種物種中miRNA結(jié)合位點(diǎn)的保守性分析，通過對大量已知miRNA-靶基因?qū)Φ难芯?，建立起一套預(yù)測模型，從而識(shí)別出與hsa-miR-365a可能結(jié)合的3’UTR區(qū)域。在對MCF-7細(xì)胞的研究中，通過該軟件預(yù)測出多個(gè)潛在靶基因，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了重要線索。在眾多預(yù)測得到的潛在靶基因中，HSPA8、c-Myc等基因因與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)過程密切相關(guān)而備受關(guān)注。以HSPA8為例，它是熱休克蛋白70（HSP70）家族的成員，編碼73kDa的熱休克同源蛋白Hsc70，在促進(jìn)蛋白折疊及維持其正常的結(jié)構(gòu)和功能中扮演著重要角色。以往的研究表明，Hsc70在正常狀態(tài)或是應(yīng)激狀態(tài)下對維持蛋白的動(dòng)態(tài)平衡，如轉(zhuǎn)運(yùn)、組裝、降解等過程中起關(guān)鍵作用。c-Myc作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在腫瘤細(xì)胞中，c-Myc的異常表達(dá)常常導(dǎo)致細(xì)胞生長失控和惡性轉(zhuǎn)化。這些基因在細(xì)胞生理和病理過程中的重要性，使其成為hsa-miR-365a作用機(jī)制研究的重點(diǎn)對象。為了驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。該實(shí)驗(yàn)的原理是利用雙熒光素酶系統(tǒng)，將潛在靶基因的3’UTR區(qū)域克隆到含有螢火蟲熒光素酶基因的報(bào)告載體中，同時(shí)共轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶報(bào)告載體作為內(nèi)參，以校正細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對實(shí)驗(yàn)的影響。將構(gòu)建好的報(bào)告載體與hsa-miR-365a模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，48小時(shí)后利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。若hsa-miR-365a模擬物轉(zhuǎn)染組的螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值顯著低于陰性對照轉(zhuǎn)染組，則表明hsa-miR-365a與靶基因3’UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。以HSPA8基因的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為例，將含有HSPA8基因3’UTR的熒光素酶報(bào)告載體與hsa-miR-365a模擬物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后，檢測結(jié)果顯示，與陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，hsa-miR-365a模擬物轉(zhuǎn)染組的熒光素酶相對活性顯著降低，表明hsa-miR-365a能夠與HSPA8基因的3’UTR特異性結(jié)合，從而抑制熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，證實(shí)了HSPA8是hsa-miR-365a的直接靶基因。在對c-Myc基因的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了c-Myc也是hsa-miR-365a的靶基因之一。為了進(jìn)一步確認(rèn)hsa-miR-365a與靶基因之間的相互作用，本研究還采用了定點(diǎn)突變技術(shù)。對靶基因3’UTR中與hsa-miR-365a結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，然后將突變后的3’UTR構(gòu)建到熒光素酶報(bào)告載體中，重復(fù)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。若hsa-miR-365a模擬物對突變后的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)無明顯影響，則說明hsa-miR-365a與靶基因的結(jié)合具有位點(diǎn)特異性。在對HSPA8基因的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)中，將3’UTR中與hsa-miR-365a互補(bǔ)配對的關(guān)鍵核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行突變后，共轉(zhuǎn)染hsa-miR-365a模擬物和突變后的熒光素酶報(bào)告載體，結(jié)果顯示熒光素酶活性未受到明顯抑制，與陰性對照轉(zhuǎn)染組無顯著差異，進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-365a與HSPA8基因3’UTR的結(jié)合具有高度特異性。4.2相關(guān)信號(hào)通路研究在確定了hsa-miR-365a的靶基因后，深入研究這些靶基因所參與的信號(hào)通路對于揭示hsa-miR-365a抑制MCF-7細(xì)胞的分子機(jī)制至關(guān)重要。其中，PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著核心作用，且與c-Myc、HSPA8等靶基因密切相關(guān)。PI3K/AKT信號(hào)通路是一條經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞的生長、增殖、存活和代謝等過程中扮演著關(guān)鍵角色。該通路的激活始于細(xì)胞表面受體與配體的結(jié)合，如生長因子受體與相應(yīng)生長因子的結(jié)合，從而激活受體的酪氨酸激酶活性。激活的受體通過招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基p85，使PI3K的催化亞基p110被激活。激活的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，招募并激活蛋白激酶B（AKT）。AKT通過磷酸化一系列下游底物，如糖原合成酶激酶3（GSK3）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）等，發(fā)揮其生物學(xué)功能。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號(hào)通路常常被異常激活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻以及遷移和侵襲能力增強(qiáng)。MAPK信號(hào)通路也是一條重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三條分支。以ERK通路為例，當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子、激素等外界刺激時(shí)，細(xì)胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK）被激活，激活的RTK通過招募Grb2和鳥苷酸交換因子SOS，使Ras蛋白從無活性的GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腉TP結(jié)合狀態(tài)。激活的Ras進(jìn)一步激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活MEK激酶，MEK激酶再磷酸化激活ERK激酶。激活的ERK激酶進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化并激活一系列轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，從而調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和遷移等生物學(xué)過程。在腫瘤細(xì)胞中，MAPK信號(hào)通路的異常激活也與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為了探究hsa-miR-365a對PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的影響，本研究通過Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測了相關(guān)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平和磷酸化狀態(tài)。結(jié)果顯示，過表達(dá)hsa-miR-365a后，PI3K/AKT信號(hào)通路中p-AKT（磷酸化AKT）的表達(dá)水平顯著降低，而總AKT的表達(dá)水平無明顯變化，表明hsa-miR-365a能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。在MAPK信號(hào)通路中，過表達(dá)hsa-miR-365a導(dǎo)致p-ERK（磷酸化ERK）的表達(dá)水平顯著降低，總ERK的表達(dá)水平基本不變，說明hsa-miR-365a也能夠抑制MAPK信號(hào)通路中ERK的磷酸化激活。這表明hsa-miR-365a可能通過抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-365a對PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的抑制作用與靶基因c-Myc和HSPA8密切相關(guān)。干擾c-Myc或HSPA8的表達(dá)后，PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平也顯著降低，與過表達(dá)hsa-miR-365a的效果相似。這說明hsa-miR-365a可能通過靶向抑制c-Myc和HSPA8的表達(dá)，進(jìn)而抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的激活，最終發(fā)揮對MCF-7細(xì)胞的抑制作用。為了驗(yàn)證這一推測，本研究進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)，在過表達(dá)hsa-miR-365a的同時(shí)，過表達(dá)c-Myc或HSPA8，結(jié)果顯示PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平有所回升，MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力也部分恢復(fù)。這進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-365a通過靶向抑制c-Myc和HSPA8的表達(dá)，抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制MCF-7細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。4.3機(jī)制總結(jié)綜上所述，本研究揭示了hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其分子機(jī)制。hsa-miR-365a能夠通過與靶基因mRNA的3’UTR特異性結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)。通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，確定了HSPA8和c-Myc等為hsa-miR-365a的直接靶基因。HSPA8編碼的熱休克同源蛋白Hsc70在促進(jìn)蛋白折疊及維持其正常結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用，c-Myc作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程進(jìn)行著核心調(diào)控。hsa-miR-365a通過靶向抑制HSPA8和c-Myc的表達(dá)，阻斷了相關(guān)信號(hào)通路的激活。PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中起著關(guān)鍵作用。hsa-miR-365a抑制了PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT的磷酸化激活，以及MAPK信號(hào)通路中ERK的磷酸化激活，從而抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。本研究表明hsa-miR-365a通過靶向調(diào)控HSPA8、c-Myc等靶基因，抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用。這一研究結(jié)果為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為乳腺癌的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)和治療策略。五、結(jié)論與展望5.1研究總結(jié)本研究深入探究了hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在抑制作用方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確表明hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為具有顯著的抑制效果。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)等多種細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hsa-miR-365a能夠明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞生長速度減緩，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，采用流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinV-FITC/PI雙染法等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-365a能夠顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，增加凋亡細(xì)胞的比例，同時(shí)上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白如Bax、CleavedCaspase-3的表達(dá)水平，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，利用Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法觀察到，hsa-miR-365a能夠有效抑制MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使細(xì)胞的遷移距離縮短，侵襲到下層小室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明了hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞的生長、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為具有重要的調(diào)控作用，能夠顯著抑制MCF-7細(xì)胞的惡性表型。在作用機(jī)制方面，本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法，成功驗(yàn)證了HSPA8和c-Myc為hsa-miR-365a的直接靶基因。HSPA8編碼的熱休克同源蛋白Hsc70在維持蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。c-Myc作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程進(jìn)行著核心調(diào)控。hsa-miR-365a通過與HSPA8和c-Myc基因mRNA的3’UTR特異性結(jié)合，抑制了它們的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞的抑制作用與PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)。PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中起著關(guān)鍵作用。hsa-miR-365a通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路中AKT的磷酸化激活，以及MAPK信號(hào)通路中ERK的磷酸化激活，阻斷了這些信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制了MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。干擾c-Myc或HSPA8的表達(dá)后，PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平顯著降低，與過表達(dá)hsa-miR-365a的效果相似。回復(fù)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了hsa-miR-365a通過靶向抑制c-Myc和HSPA8的表達(dá)，抑制PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮對MCF-7細(xì)胞的抑制作用。本研究揭示了hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其分子機(jī)制，為深入理解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角，也為乳腺癌的治療提供了潛在的分子靶點(diǎn)和治療策略。5.2研究不足與展望盡管本研究在hsa-miR-365a對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制作用及其機(jī)制方面取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處，有待進(jìn)一步完善和深入研究。本研究主要在細(xì)胞水平上進(jìn)行，雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^為直觀地揭示hsa-miR-365a對MCF-7細(xì)胞的作用機(jī)制，但與體內(nèi)環(huán)境存在一定差異。未來研究可考慮構(gòu)建乳腺癌動(dòng)物模型，如裸鼠移植瘤模型，將過表達(dá)或抑制hsa-miR-365a的MCF-7細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移情況以及hsa-miR-365a對腫瘤微環(huán)境的影響，從而更全面地評估hsa-miR-365a在體內(nèi)的抗腫瘤作用。本研究雖然確定了HSPA8和c-Myc為hsa-miR-365a的靶基因，并初步探討了它們參與的PI3K/AKT和MAPK信號(hào)通路，但hsa-miR-365a可能還存在其他未知的靶基因和作用通路。生物信息學(xué)預(yù)測只是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)和算法進(jìn)行的推測，可能存在遺漏。未來可采用高通量測序技術(shù)，如RNA-seq、ChIP-seq等，全面篩選和鑒定hsa-miR-365a的靶基因及其調(diào)控的信號(hào)通路，進(jìn)一步完善hsa-miR-365a的作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。本研究未對hsa-miR-365a在乳腺癌臨床樣本中的表達(dá)情況進(jìn)行大規(guī)模分析，其表達(dá)水平與乳腺癌患者的臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系尚不清楚。未來可收集大量乳腺癌患者的組織樣本和臨床資料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組織化學(xué)等技術(shù)檢測hsa-miR-365a及相關(guān)靶基因的表達(dá)水平，分析其與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、生存時(shí)間等臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評估和個(gè)體化治療提供更有力的依據(jù)。目前針對hsa-miR-365a的研究主要集中在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，其在乳腺癌治療中的臨床應(yīng)用還面臨諸多挑戰(zhàn)。如何將hsa-miR-365a安全有效地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，以及如何避免其對正常細(xì)胞的潛在副作用，是亟待解決的問題。未來需要研發(fā)高效、安全的miRNA遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、納米顆粒、外泌體等，提高h(yuǎn)sa-miR-365a的遞送效率和靶向性。還需開展更多的臨床前研究和臨床試驗(yàn)，評估hsa-miR-365a作為乳腺癌治療靶點(diǎn)的安全性和有效性，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，hsa-miR-365a有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)，為乳腺癌患者帶來新的治療希望。未來的研究將圍繞上述不足展開，進(jìn)一步揭示hsa-miR-365a在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，推動(dòng)其從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。六、參考文獻(xiàn)[1]BrayF,FerlayJ,SoerjomataramI,etal.Globalcancerstatistics2018:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:acancerjournalforclinicians,2018,68(6):394-424.[2]陳萬青，鄭榮壽。中國女性乳腺癌發(fā)病死亡和生存狀況[J].中國腫瘤臨床，2015,42(13):668-674.[3]VogelsteinB,PapadopoulosN,VelculescuVE,etal.Cancergenomelandscapes[J].Science,2013,339(6127):1546-1558.[4]HanahanD,WeinbergRA.Hallmarksofcancer:thenextgeneration[J].Cell,2011,144(5):646-674.[5]BartelDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell,2004,116(2):281-297.[6]AmbrosV.ThefunctionsofanimalmicroRNAs[J].Nature,2004,431(7006):350-355.[7]CalinGA,CroceCM.MicroRNAsignaturesinhumancancers[J].Naturereviewscancer,2006,6(11):857-866.[8]劉春燕，黃建鳴，陳艷珍，等.hsa-miR-365a在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2017,33(7):767-770.[9]李婷，李麗，許青霞，等.hsa-miR-365a通過靶向調(diào)控HSPA8抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[J].中國腫瘤生物治療雜志，2019,26(11):1187-1192.[10]ZhaoX,ZhangL,ZhangY,etal.miR-365a-3psuppressescolorectalcancerdevelopmentbytargetingBMI1anddownregulatingstemness-relatedgenes[J].Oncotarget,2017,8(21):34197-34208.[11]趙雪，張莉，張燕，等.miR-365a-3p通過靶向BMI1下調(diào)干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[J].腫瘤，2017,37(6):610-617.[12]MaX,ZhaoY,ChenX,etal.miR-365suppressescellproliferation,migration,andinvasioninhepatocellularcarcinomabytargetingmultiplegenes[J].Oncologyreports,2015,33(1):279-286.[13]馬雪，趙艷，陳雪，等.miR-365通過靶向多個(gè)基因抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[J].臨床肝膽病雜志，2015,31(1):54-58.[14]李潔，李芳，王芳，等。乳腺癌細(xì)胞MCF-7耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2019,27(13):2383-2387.[15]王芳，李潔，李芳，等。乳腺癌細(xì)胞MCF-7新型治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019,25(14):2745-2750.[16]VictorAmbros.microRNApathwaysinfliesandworms:growth,death,fat,stress,andtiming[J].Cell,2003,113(6):673-676.[17]GaryRuvkun.GlimpsesofatinyRNAworld[J].Science,2001,294(5543):797-799.[18]LeeRC,FeinbaumRL,AmbrosV.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.[19]BartelDP,BartelB.MicroRNAs:attherootofplantdevelopment?[J].PlantPhysiology,2003,132(3):1169-1173.[20]Lagos-QuintanaM,RauhutR,LendeckelW,etal.IdentificationofnovelgenescodingforsmallexpressedRNAs[J].Science,2001,294(5543):853-858.[21]Lagos-QuintanaM,RauhutR,YalcinA,etal.Identificationoftissue-specificmicroRNAsfrommouse[J].CurrentBiology,2002,12(9):735-739.[22]LauNC,LimLP,WeinsteinEG,etal.AnabundantclassoftinyRNAswithprobableregulatoryrolesinCaenorhabditiselegans[J].Science,2001,294(5543):858-862.[23]LimLP,LauNC,Garrett-EngeleP,etal.MicroarrayanalysisshowsthatsomemicroRNAsdownregulatelargenumbersoftargetmRNAs[J].Nature,2005,433(7027):769-773.[24]LewisBP,ShihIH,Jones-RhoadesMW,etal.PredictionofmammalianmicroRNAtargets[J].Cell,2003,115(7):787-798.[25]BrenneckeJ,StarkA,RussellRB,etal.PrinciplesofmicroRNA-targetrecognition[J].PLoSBiology,2005,3(3):e85.[26]Esquela-KerscherA,SlackFJ.Oncomirs-microRNAswitharoleincancer[J].Naturereviewscancer,2006,6(4):259-269.[27]CroceCM.CausesandconsequencesofmicroRNAdysregulationincancer[J].Naturereviewsgenetics,2009,10(10):704-714.[28]ChangTC,MendellJT.miRNAsinmammals:function,mechanism,andtherapeuticpotential[J].Trendsinmolecularmedicine,2007,13(4):157-165.[29]O'DonnellKA,WentzelEA,ZellerKI,etal.c-Myc-regulatedmicroRNAsmodulateE2F1expression[J].Nature,2005,435(7043):839-843.[30]HeL,ThomsonJM,HemannMT,etal.AmicroRNApolycistronasapotentialhumanoncogene[J].Nature,2005,435(7043):828-833.[31]ZhangB,PanX,CobbGP,etal.microRNAsasoncogenesandtumorsuppressors[J].Developmentalbiology,2007,302(1):1-12.[32]HanahanD,WeinbergRA.Thehallmarksofcancer[J].Cell,2000,100(1):57-70.[33]JemalA,SiegelR,XuJ,etal.Cancerstatistics,2010[J].CA:acancerjournalforclinicians,2010,60(5):277-300.[34]SiegelR,NaishadhamD,JemalA.Cancerstatistics,2013[J].CA:acancerjournalforclinicians,2013,63(1):11-30.[35]TorreLA,BrayF,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics,2012[J].CA:acancerjournalforclinicians,2015,65(2):87-108.[36]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CA:acancerjournalforclinicians,2016,66(2):115-132.[37]SouleHD,VazquezJ,LongA,etal.Ahumancelllinefromapleuraleffusionderivedfromabreastcarcinoma[J].JournaloftheNationalCancerInstitute,1973,51(6):1409-1416.[38]HorwitzKB,McGuireWL.Steroidreceptorassaysinbreastcancer[J].Cancer,1978,41(5Suppl):2081-2088.[39]KingWJ,GreeneGL.Monoclonalantibodieslocalizeoestrogenreceptorinthenucleioftargetcells[J].Nature,1984,307(5947):745-747.[40]DicksonRB,LippmanME.Growthfactorsinbreastcancer[J].Endocrinereviews,1987,8(1):29-43.[41]OsborneCK,SchiffR.Estrogenreceptor-positivebreastcancer:endocrinetherapyandmechanismsofresistance[J].Seminarsinoncology,2011,38(4):431-442.[42]SchiffR,RanganathanE,LeclercqG,etal.Modulationofinsulin-likegrowthfactor-bindingproteinsecretionbyantiestrogentreatmentofhumanbreastcancercells[J].Cancerresearch,1990,50(16):5370-5377.[43]ColeMD.Themyconcogene:itsroleintransformationanddifferentiation[J].Annualreviewofgenetics,1986,20:361-385.[44]DangCV.c-Myctargetgenesinvolvedincellgrowth,apoptosis,andmetabolism[J].Molecularandcellularbiology,1999,19(1):1-11.[45]AmatiB,LittlewoodTD,EvanGI,etal.Oncogenicactivityofthec-MycproteinrequiresdimerizationwithMax[J].Cell,1992,71(4):777-786.[46]BlackwoodEM,EisenmanRN.Max:ahelix-loop-helixzipperproteinthatformsasequence-specificDNA-bindingcomplexwithMyc[J].Science,1991,251(4990):1211-1217.[47]KretznerL,BlackwoodEM,EisenmanRN.ThebasicregionofMycproteinisrequiredforspecificDNAbindinginassociationwithMax[J].Genes&development,1992,6(11):2112-2124.[48]EilersM,EisenmanRN.Mycproteinsandtranscriptionalregulation[J].Currentopinioningenetics&development,1992,2(2):177-182.[49]GrandoriC,CowleySM,JamesLP,etal.Th