PLA63750-SOP-006《新型冠狀病毒2019-nCoV核酸單檢樣本檢測標準操作規(guī)程》第頁共10頁文件名稱新型冠狀病毒2019-nCoV核酸單檢樣本檢測標準操作規(guī)程文件編號PLA63750-SOP-006版本/修訂號D/0編制人審核人批準人生效日期1.檢驗目的體外定性檢新型冠狀病毒(2019-nCoV)ORF1ab和N基因，用于新型冠狀病毒感染的體檢篩查。2.檢測原理與方法對新型冠狀病毒(2019-nCoV)ORF1ab及編碼核衣殼蛋白N基因的特異性保守序列為靶區(qū)域,進行了雙靶標基因的設計,配以PCR反應液,在熒光定量PCR儀上,應用實時熒光定量RT-PCR檢測技術,通過熒光信號的變化實現(xiàn)樣本RNA的檢測。PCR檢測體系包含有內(nèi)源性的內(nèi)標引物和探針,通過檢測內(nèi)標是否正常來監(jiān)測樣本采集、提取過程,避免假陰性結果。3.職責保證分子生物組實驗室對于新型冠狀病毒(2019-nCoV)篩查檢測結果的可靠性。4.性能特征4.1準確性檢測企業(yè)陽性參考品,結果均為陽性。4.2特異性本試劑盒與冠狀病毒(NL63,HKU1,229E,OC43)、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒Yamagata型、Victoria型、甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H7N9流感病毒、呼吸道合胞病毒A、B型、鼻病毒A、B、C型、腺病毒1、2、3、4、5、7、55型、副流感病毒1、2、3型、腸病毒A、B型、腸病毒C型(EV-C95)、腸病毒D型(EV-D70)、偏肺病毒、人間質肺病毒、新生隱球菌、化膿性性鏈球菌、鮑曼不動桿菌、肺孢子蟲、肺炎克雷伯桿菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌、百日咳桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎衣原體、EB病毒、人巨細胞病毒、煙曲霉、白色念球菌、光滑念珠菌、結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌、諾如病毒、輪狀病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人類基因組DNA等陽性樣本無交叉反應。檢測企業(yè)陰性參考品均為陰性。?4.3精密度批內(nèi)精密度Ct值的變異系數(shù)(CV,%)≤5%。?4.4最低檢測限本試劑盒最低檢測限為200copies/mL。5.標本類型及要求5.1樣本類型:咽拭子、肺泡灌洗液。5.2樣本采集:5.2.1咽拭子：用1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入含1.5ml病毒保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。5.2.2肺泡灌洗液：局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經(jīng)過咽部插入右肺中葉或左肺舌段的支管，將其頂端契入支氣管分支開口，經(jīng)氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水，每次30～50ml，總量100～250ml，不應超過300ml。5.3樣本滅活：將樣本保存管置于金屬浴56℃以上保持30分鐘。5.4樣本保存和運送:待測樣本可立即用于處理,能在24小時內(nèi)檢測的標本可置于4℃保存；24小時內(nèi)無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存(如無-70℃保存條件,待測樣本可于-20℃保存10天,核酸樣本-20±5℃保存15天)。應避免反復凍融。樣本運送采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。6.標本包裝和運輸6.1標本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內(nèi)分裝。6.2所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里，擰緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。6.3將密閉后的標本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封，每袋裝一份標本。樣本包裝要求要符合《危險品航空安全運輸技術細則》相應的標準。6.4涉及外部標本運輸?shù)?，應根?jù)標本類型，按照A類感染性物質進行三層包裝。7.試劑和儀器7.1試劑：新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒(熒光PCR法)7.1.1試劑來源：湖南圣湘生物科技有限公司7.1.2試劑組份：序號試劑名稱規(guī)格與裝量主要成分12019-nCoV-PCR-反應液624μL/管引物(4.62%)、探針(1.15%)、dNTPs(3.85%)、MgCl2(0.77%)、Rnasin(0.48%)、PCRbuffer(89.13%)22019-nCoV-PCR-酶混合液96μL/管RT酶(62.5%)、Taq酶(37.5%)32019-nCoV-PCR-陽性對照500μL/管含目標基因(ORF1ab、N基因)、內(nèi)標基因片段(RnaseP)的體外轉錄RNA42019-nCoV-PCR-陰性對照500μL/管生理鹽水7.1.3開啟所有試劑需注明日期及簽名。每個試劑盒都應貼有下列標簽：物質名稱、批號、特殊儲藏說明、開蓋人、開蓋日期、開蓋后有效期。開啟時應檢查試劑是否變色，是否有肉眼可見的細菌生長跡象、濁度、沉淀反應等，這些表示已經(jīng)變質或超過保質期。7.1.4試劑應避光密閉,試劑組分保存于-20±5℃。7.1.5生產(chǎn)日期,失效日期請見外包裝盒。不使用時,這些試劑在包裝標識的效期內(nèi)可穩(wěn)定存放。一旦使用,擴增試劑盒反復凍融應不超過3次。7.2儀器：適用于上海宏石SLAN96熒光PCR儀。8.環(huán)境和安全控制8.1檢測環(huán)境：PCR實驗室條件達到生物安全二級及以上。8.2安全控制：8.2.1檢驗人員個人防護應達到生物安全三級，至少穿戴工作服、一次性工作帽、雙層手套、醫(yī)用一次性防護服、醫(yī)用防護口罩（N95及以上）或動力送風過濾式呼吸器、防護面屏或護目鏡、工作鞋或膠靴、防水靴套。必要時，可加穿防水圍裙或防水隔離衣。根據(jù)目前實驗場地設置要求，個人防護設備在試劑配置區(qū)緩沖間進行穿戴齊全后再進入核心工作區(qū)。8.2.2避免過度勞累，并及時對其健康情況進行監(jiān)測，注意監(jiān)測自身及身邊檢驗人員體溫和呼吸系統(tǒng)癥狀。8.2.3防護裝備脫卸的注意事項：脫卸時盡量少接觸污染面。脫下的防護眼罩、長筒膠鞋等非一次性使用的物品應直接放入盛有消毒液的容器內(nèi)浸泡；其余一次性使用的物品應放入黃色醫(yī)療廢物收集袋中作為醫(yī)療廢物集中處置。脫卸防護裝備的每一步均應進行手消毒，所有防護裝備全部脫完后再次洗手、手消毒。8.2.4如果操作人員的皮膚或衣物上沾到了血液及廢液，應立刻用清水沖洗并進行消毒處理。如果眼睛被濺入血液及廢液，用大量的清水沖洗并采取必要的醫(yī)療措施。8.2.5工作臺在每天工作結束后用10%的次氯酸鈉溶液清洗，空間用紫外線照射60分鐘。8.2.6此試劑為體外用，試劑含有防腐劑和穩(wěn)定劑，存在一定的危險性；不要入口，避免和眼睛，皮膚或衣服接觸。8.2.7醫(yī)療廢物處理：本檢測所產(chǎn)生的全部廢棄物均應按《安全手冊》中有關規(guī)定執(zhí)行并遵循《醫(yī)療廢物管理條例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機構醫(yī)療廢物管理辦法》的要求，規(guī)范使用雙層黃色醫(yī)療廢物收集袋封裝后按照常規(guī)處置流程進行處置。9.操作步驟9.1試劑準備(在試劑準備區(qū)進行)；9.1.1取出盒中的各組分,室溫放置,待其溫度平衡至室溫后,混勻后備用；9.1.2根據(jù)待測樣本數(shù)量,陽性對照和陰性對照數(shù)量,按比例(2019-nCoV-PCR反應液26μL/人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4μL/人份)取相應量的組分,充分混勻成PCR混合液,瞬時離心后備用；9.1.3將上述準備好的試劑轉移至樣本處理區(qū)，待用。9.2樣本處理(在樣本處理區(qū)進行)9.2.1新型冠狀病毒2019-Ncov一步法提取核酸檢測（單檢）9.2.1.1樣本接收后打開外層包裝箱，取出內(nèi)物品，統(tǒng)一放恒溫箱內(nèi)56℃放置30min以上（目前實驗室常規(guī)使用溫度：60—65℃左右，放置30min）。滅活后取出，打開中層包裝。樣本在生物安全柜里進行再次震蕩混勻,樣本瞬時離心。每個PCR管中加入樣本釋放劑（型號S1014）10μL（建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡）；9.2.1.2各管分別加入待測標本、陰性對照、陽性對照及弱陽性對照各10μL，吸打3-5次混勻輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡），室溫靜置10分鐘以上；9.2.1.3室溫靜置10分鐘；9.2.1.4將30μL配制好的PCR-混合液加入到裝有20μL上述處理后的樣本PCR擴增管中,蓋好八連管蓋。9.2.2新型冠狀病毒2019-Ncov磁珠法提取核酸檢測（高風險人群）使用S10015核酸提取或純化試劑盒提取核酸9.2.2.1按照S10015-洗滌液2標簽指示，使用前加入相應量的無水乙醇。9.2.2.2根據(jù)樣本數(shù)量，將蛋白酶K（20μL/人份）和S10015-磁珠溶液（30μL/人份）按照比例混合成蛋白酶K-磁珠混合液，震蕩混勻，低速瞬時離心。9.2.2.3根據(jù)待測樣本數(shù)量取1.5ml離心管若干，每管加入300μL樣品，每一次實驗同時檢測一份弱陽性對照、一份空白對照、三個陰性對照；9.2.2.4加入500μLS10015-提取溶液1和50μL蛋白酶K-磁珠混合液；蓋上管蓋，震蕩混勻30s,60℃加熱10min.9.2.2.5室溫靜置1min，低速瞬時離心，將離心管置于磁性分離器上，5min后吸棄廢液（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側的磁珠）；9.2.2.6加入700μLS10015-洗滌液1，震蕩混勻30s，低速瞬時離心后將離心管再次置于磁性分離器。磁吸3min，將液體完全吸出丟棄（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側的磁珠）；9.2.2.7加入700μLS10015-洗滌液2，震蕩混勻30s，低速瞬時離心后將離心管再次置于磁性分離器。磁吸3min，將液體完全吸出丟棄，繼續(xù)于磁性分離器上靜置2min，將液體完全吸盡。（注意不要碰到吸附于管壁內(nèi)側的磁珠；若此時洗滌液并非無色透明，需重復該步驟）；9.2.2.8室溫開蓋靜置5min（乙醇殘留會對后續(xù)實驗造成不良影響，需保證乙醇充分揮發(fā)；同時不要干燥太長時間，以免磁珠掛壁難以洗脫）。9.2.2.9加入60μLS10015-洗脫液S，震蕩混勻30s,將離心管壁上磁珠洗脫到管底，室溫靜置5min；低速瞬時離心將離心管再次置于磁性分離器上磁吸3min，然后將洗脫下來的核酸轉移到干凈的1.5mL離心管中。9.2.2.10根據(jù)樣本數(shù)量，取相應量的八連管，各管分別加入提取好的待測標本、陰性對照、陽性對照及弱陽性對照各20μL，將30μL配制好的PCR-混合液加入到裝有20μL核酸的PCR擴增管中,蓋好八連管蓋。9.2.3將上述準備好的八連排轉移至擴增區(qū)處理區(qū),準備上機擴增。9.3PCR擴增9.3.1確定UPS工作狀況正常后啟動控制電腦，開上海宏石SLAN96P電源開關，打開電腦并雙擊桌面“SLAN8.2.2”圖標，打開軟件。9.3.2項目創(chuàng)建：首次操作需要進行項目創(chuàng)建，在軟件最上方的項目欄點擊項目創(chuàng)建，以后使用時就只需要調(diào)用相應項目程序就可以了。選擇熒光檢測通道選擇:?1)選擇FAM(ORF-1ab區(qū)域)和ROX(N基因)通道檢測2019-nCoV病毒核酸;?2)選擇HEX通道檢測內(nèi)標，設定循環(huán)參數(shù)完成創(chuàng)建實驗項目。循環(huán)參數(shù):步驟溫度時間循環(huán)數(shù)1逆轉錄50°C30分鐘12cDNA預變性95°C1分鐘13變性95°C15秒45退火,延伸及熒光采集60°C30秒4儀器冷卻25°C10秒19.3.3完成項目創(chuàng)建后，點擊“HOME”進行基本設置，彈出的對話框中編輯所創(chuàng)建的項目名稱+樣本號+日期，實驗名稱以及保存到相應的文件夾下，點擊“孔板編輯”選擇實驗需要運行模塊，選擇項目程序，選擇“實驗分析”模塊下點擊開始運行擴增程序。9.3.4樣本信息編輯將：將陽性對照、陰性對照及待測樣本的點樣順序設置并設置樣本名稱和實驗項目。9.3.5實驗結果分析：反應結束后自動保存結果，對檢測靶標以及內(nèi)標的擴增曲線分別進行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start值可以在3~15、End值可設在5~20，調(diào)整陰性對照的擴增曲線使其平直或低于閾值線)，點擊Analyze進行分析,使各項參數(shù)符合下述“10.質量控制”中的要求，然后到Plate窗口下記錄定性結果。點擊軟件界面上方文件的下拉菜單打開可以直接打開上機文件，選擇右側分析類型，左上角的1～6數(shù)字鍵可以選擇對應的通道進行分析。9.3.6實驗結果的導出：點擊左上角的文件，在其下拉菜單中有導出，選擇實驗結果，可以導出*.xls格式的實驗文件。10.質量控制10.12019-nCoV-PCR-陰性對照:FAM、ROX通道及內(nèi)標(HEX)通道均無Ct值或Ct>40；10.22019-nCoV-PCR-陽性對照:FAM、ROX及內(nèi)標(HEX)通道均Ct≤35；2019-nCoV-PCR–弱陽性對照:FAM、ROX及內(nèi)標(HEX)通道均Ct≤40；10.3以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需重新進行。11.干擾和交叉反應11.1標本檢測結果與標本收集、處理、運送及保存質量有關，其中任何失誤都將會導致結果不準確。如果標本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結果。11.2樣本中可能存在的干擾物質：100μg/mL鹽酸羥甲唑啉、50μg/mL地塞米松、50μg/mL鹽酸頭孢甲肟、100μg/mL奧司他韋、100μg/mL扎那米韋、100μg/mL利巴韋林、100μg/mL阿奇霉素、300U/mLα-干擾素、320μg/mL布地奈德、125μg/mL苯福林、100μg/mL妥布霉素、50μg/mL倍氯美松、100μg/mL氟尼縮松、100μg/mL莫米松、200μg/mL氟替卡松、200μg/mL鹽酸組胺、100μg/mL帕拉米韋、100μg/mL洛匹那韋、100μg/mL莫匹羅星、100μg/mL曲安奈德、100μg/mL利托那韋、100μg/mL阿比多爾、60μg/mL氯化鈉、100μg/mL尿素、10μg/mL血紅素、20μg/mL純化粘蛋白、20%(v/v)無水乙醇、20%(v/v)人全血對試劑盒的檢測結果無明顯干擾。12．參考范圍本方法檢測下限為200IU/ml，檢測目標基因的Ct參考值為40；內(nèi)標Ct的參考值為40。13.檢驗結果分析13.1對于FAM和ROX通道均檢測到典型的S型擴增曲線，且Ct≤40的樣本，更換檢驗人員，使用兩種不同廠家的新型冠狀病毒核酸檢測試劑提取樣本核酸進行復核，若結果ORFIab和N基因同時陽性時,判定為陽性；若僅ORF1a或N基因其中之一檢測結果陽性時,需重新采樣復查,復查后ORPlab或N基因仍為陽性時,判定為陽性,并采用其他試劑成方法進行確認；報告為2019-nCoV病毒“初篩陽性待復查”，并將標本送至疾控確診。13.2對于FAM或ROX通道出現(xiàn)單靶標檢測到典型的S型擴增曲線，且Ct≤40的樣本，使用不同廠家的新型冠狀病毒核酸檢測試劑重新提取樣本核酸進行復查，若仍為單靶標陽性，則重新采樣進行復檢；如果仍為單靶標陽性，報告為2019-nCoV病毒“初篩陽性待復查”，并將標本送至疾控確診；否則判斷為陰性。13.3Ct值位于灰區(qū)，當出現(xiàn)Ct值在37-40之間時為灰度區(qū)?？赡艽嬖谙铝星闆r:2個位點的檢測結果均處于“灰度區(qū)”；1個位點判讀為陽性,另1個立點的結果處于“灰度區(qū)”1個位點判讀為陰性,另1個位點的結果處于“灰度區(qū)”。出現(xiàn)以上情況時宜重新提取原標本的核酸,并與該標本前一次提取的核酸同時擴增檢