13I2抗豆象綠豆品種真實(shí)性和純度鑒定SSR分子標(biāo)記法下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本GB/T3543.1農(nóng)作物種子檢驗(yàn)GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)GB/T3543.5農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程真實(shí)性和品種純度GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和綠豆象(CallosobruchusCh在人工接種豆象鑒定的條件下，種子被害率小于65%的綠品種在特征特性方面典型一致的程度，用與供檢品種標(biāo)準(zhǔn)特征特性表現(xiàn)一致的本品種的種子數(shù)SSR分子標(biāo)記（SimpleSequenceRepeatsM也稱(chēng)為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)標(biāo)記，是基于單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單元在數(shù)量上的變異而發(fā)展起來(lái)一種分子標(biāo)記。微衛(wèi)星中重復(fù)單位的數(shù)目在不同材料中存在高度變異，但其兩側(cè)的序列一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，根據(jù)這一特征設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而可以將單個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增出來(lái)。由于重復(fù)單元的重復(fù)數(shù)目不同就產(chǎn)生擴(kuò)從大量引物中篩選出的一組擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性較好、帶型分布合理、能夠用于區(qū)分不同材料遺3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)，是一種在高速離心機(jī)；PCR擴(kuò)增儀；高壓電泳儀(3000V,400mA,400W);DNA序列分析電泳槽；電子天平(0.01g,0.001g);研缽或組織研磨儀；水浴鍋；通風(fēng)櫥；微量加樣器(0.5μL～10μL,204.2試劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB);氯化鈉；三氯甲烷(氯仿);異戊醇；β-巰基乙醇；三羥甲基氨基甲烷(Tris堿);37%濃鹽酸；乙二胺四乙酸二鈉(Na?EDTA-2H?0);氫氧化鈉；硼酸；40%非變性聚丙烯酰胺母液(19:1);四甲基乙二胺(TEMED);過(guò)硫酸銨；硝酸銀；甲醛；乙醇。預(yù)熱的2%CTABDNA提取液(配方見(jiàn)表B.3),渦旋震蕩1min。6.1.2將離心管置于65℃水浴40min,每10min顛倒混勻一次。將樣品從水浴鍋中取出，靜置片刻，加入800μL氯仿與異戊醇的混合液(24氯仿：1異戊醇),混勻15min,然后靜置10min,10000r/min室溫離心10min。10000r/min離心10min,倒掉上清液，留沉淀。6.1.5重復(fù)步驟6.1.4一次。6.1.6將離心管開(kāi)口朝下傾斜放置，便于多余乙醇流出，室溫干燥1h或50℃烘干20min。加入150μL滅菌ddH?0或1×TE(配方見(jiàn)表B.4),置65℃水浴鍋溶解1h。46.1.7取出離心管，放置至室溫，10000r/min離心2min,將上清液吸取到新的1.5mL離心管1.7～2.0之間，并稀釋到20ng/μL備用。利用本標(biāo)準(zhǔn)附表A.1中給出的30對(duì)綠豆SSR核心引物對(duì)受檢樣品DNA及標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在冰盤(pán)中或4℃條件下按表1所列成分和用量，依次加入PCR管，準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系。DNA模版(20ng/μL)41反向引物(2μmol/L)14總體積注：2×UTaqPCRMasterMix包含UtaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl?、反應(yīng)緩沖液，濃度為2×,含溴酚藍(lán)和二甲苯程序設(shè)定反應(yīng)時(shí)間備注123不同SSR引物所需的退火溫度有差異472℃延伸5672℃延伸最后用75%乙醇擦拭，并空置晾干。5marker（最小片段100bp）作為擴(kuò)增片段大小的指示標(biāo)記W；電泳時(shí)間根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小進(jìn)行調(diào)整，一般可在二甲苯青指示劑條帶剛剛跑出膠板時(shí)停止電泳。下板后將凝膠從玻璃板上取下，用蒸餾水沖洗凝膠1～2次，以洗掉殘留的電泳緩沖液。用終濃度為0.1%（w/w）的AgNO3染色液染色1用蒸餾水沖洗凝膠1～2次，然后使用1.5%（w/w）NaOH（引物從標(biāo)準(zhǔn)樣品和檢測(cè)樣品中擴(kuò)增出的條帶數(shù)及其分子量大小，按“有”對(duì)應(yīng)條帶記錄為“1”，“無(wú)”對(duì)應(yīng)條帶記錄為“0”的方法記錄每對(duì)SSR引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果。在引物等位變異片段大小范圍內(nèi)異性擴(kuò)增還是新增的稀有等位變異。采用單個(gè)個(gè)體擴(kuò)增的產(chǎn)物，出現(xiàn)3種或3種以上的多帶則為非特異性擴(kuò)增；采用混合試樣提取的，某些位點(diǎn)出現(xiàn)3種或3種以上的譜帶，則需要通過(guò)單個(gè)個(gè)體進(jìn)行甄利用附錄A中30個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品電泳分析的結(jié)果，計(jì)算差異位點(diǎn)數(shù)量，核實(shí)差異位點(diǎn)編號(hào)。檢測(cè)結(jié)果用樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品比較的位點(diǎn)差異數(shù)表示。若在所檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果使用正常個(gè)體數(shù)目（檢測(cè)試樣總數(shù)減去非典型個(gè)體數(shù)目）占檢測(cè)試樣總數(shù)的百分率表6b)通過(guò)對(duì)引物，使用混合試樣，采用8%（w/w）非變性聚丙烯酰胺測(cè)，與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較檢測(cè)出差異位點(diǎn)個(gè)，差異位點(diǎn)7表A.1規(guī)定了30對(duì)綠豆SSR核心引物及相關(guān)序號(hào)1723425967689928553958序號(hào)64318A54534G21Mchr5-5注：標(biāo)記syd404和Mch